兔骨髓间充质干细胞联合geneX/TGF-β2体外培养成骨分化的实验研究

作     者：李多玉 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：龚跃昆

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：geneX 骨髓间充质干细胞(BMSCs) 转化生长因子-β2(TGF-β2) 成骨分化 成骨诱导 

摘      要：目的： geneX人工骨是采用p-磷酸三钙和硫酸钙混制而成,该材料降解速度与新生骨匹配,早期强度接近骨皮质,是松质骨的三倍,能体内完全降解,是一种较好的骨移植替代材料。本研究将兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)与geneX人工骨及转化生长因子-β2(TGF-β2)联合进行体外培养,探讨geneX与BMSCs的组织相容性及geneX和TGF-β2对BMSCs增殖、分化的影响,为进一步将geneX应用于早期股骨头坏死的治疗研究提供可靠的理论依据。 方法： 1、BMSCs的分离、培养：严格遵守无菌操作原则取出健康新西兰大白兔的双侧股骨干。使用贴壁法可以除去没有贴壁的悬浮细胞,分离纯化细胞,根据骨髓间充质干细胞可以贴壁生长而血细胞在培养液中反而悬浮生长的特性差异,我们通过定期换液来达到纯化骨髓间充质干细胞的目的。置于培养箱中培养,3至4天观察并换液,至细胞长满后传代,此时记为P1代;经过反复多次的传代培养能够获得较为纯净的贴壁细胞。当传至P3代时,使用免疫组化检测贴壁细胞的表面标记物CD44,可以证实所得的细胞为骨髓间充质干细胞,骨髓间充质干细胞纯度比较高,且形态稳定,故选取此代细胞用于后续实验。 2、geneX支架材料的制作：在无菌工作台上严格无菌操作制作geneX支架材料,取出一支geneX人工骨粉末的注射器A,另外一支2ml无菌生理盐水的注射器B,按照说明将两支注射器用连接器连接,将含有生理盐水的注射器B里的生理盐水通过连接器注射到注射器A管里,使生理盐水和geneX人工骨粉末混合成泥状,再将A管里的泥状geneX人工骨注射回B管里,这样快速的来回的将泥状geneX人工骨在两支注射器里充分混匀(大约1分钟完成),最后将泥状geneX人工骨材料打到A管里,然后将B管和连接器从A管上小心的取下,取出排出注射连接器接在A管的注射器接头上,然后在无菌洁净干燥的孔状模型上打出长约3mmX2.5mm大小形状相似的柱状geneX模型38块,取出一块geneX支架材料进行电镜观察,将其余37块geneX模型放在DMEM培养液中浸泡,以备下一步复合及体外实验备用。 3、geneX与BMSCs的复合：取成骨诱导培养的BMSCs,以0.25%的胰酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM培养液洗涤2次,然后以无血清培养液悬浮至终浓度为2×104/ml,接种到已经处理好的37块geneX支架材料中,使geneX支架材料刚好被BMSCs细胞悬液浸润。将复合的geneX与BMSCs放在培养瓶中进行共培养,隔日换液一次,5天后并在保证无菌操作的条件下将构建的骨块进行翻面,使细胞能够更加均匀地分布于geneX人工骨支架材料表面,以备下一步体外培养备用,并取出一块geneX支架材料在电镜下观察其结构。 4、geneX与BMSCs复合后的分组体外培养及检测：在前序实验得出的结论下得知lng/ml的TGF-β2是能促进骨髓间充质干细胞成骨的最适浓度,每瓶加入45ml的BMSCs细胞培养基。将P3代细胞分为三组,A组中加入的45ml含有传至3代的骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨诱导分化剂培养基组;B组中加入含有45ml骨髓间充质干细胞(BMSCs)+geneX支架材料的成骨诱导分化剂培养基组;C组中加入含45ml骨髓间充质干细胞(BMSCs)+geneX支架材料+5ml浓度为lOng/ml的TGF-β2的成骨诱导分化剂培养基组(整个溶液中TGF-β2的浓度为lng/ml)。一共接种54瓶,每组接种18瓶,共取54个样品。对照组和实验组均在相同的环境下进行培养。分别取第7天、第14天和第21天三个时间点在骨髓间充质干细胞培养基下对不同组进行细胞形态学观察,以及碱性磷酸酶(ALP)活性检测、MTT检测,甲基百里香酚兰检测细胞中钙离子含量以及茜素红染色观察钙积累情况。 结果 1、BMSCs的细胞形态学观察：骨髓间充质干细胞(BMSCs)在严格无菌操作分离培养后48小时即可见细胞贴壁生长,类似成纤维细胞样,大约在96小时后,细胞形态开始转变为长梭形,大量贴壁,开始形成集落,多次对细胞进行换液,当传代至第三代时,对纯化后的细胞用免疫化学法进行检测CD44(+)和不同时间点进行细胞贴壁率检测,结果表明我们所分离得到的为骨髓间充质干细胞,且纯度已达到95%,可以为后续试验做备用。 2、BMSCs的成骨诱导培养：用上述得到的纯度为95%的骨髓间充质干细胞在成骨诱导分化培养基进行培养,随着时间的延长,细胞呈现聚集生长,复层生长,没有接触抑制,3W后形成明显的圆形或卵圆形钙化结节,结节周围的细胞大多呈放射状分布。 3、扫描电镜分别观察geneX支架材料及geneX与BMSCs复合后：两者电镜对比可见成骨诱导分化的BMSCs和geneX