Bim蛋白在慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡中的作用

作     者：李国东 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯丽英

授予年度：2010年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：肝炎 乙型 慢性 激活诱导细胞死亡 Bim PBMC 

摘      要：目的:慢性乙型肝炎是威胁人类健康的传染病之一,主要是由乙肝病毒持续感染引起的。乙肝病毒是嗜肝病毒,主要通过免疫损伤引起肝细胞的破坏,如不及时清除将会引起肝脏反复的炎症,最终导致肝硬化,甚至肝癌。 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人体后,机体的免疫反应决定着疾病的发生、发展与转归。在慢性乙型肝炎(Chronic viral hepatitis B, CHB)患者中,CD4+T细胞和病毒特异性的CD8+T细胞(cytotoxic T l- ymphocyte,CTL)减少,造成免疫功能降低,导致乙型肝炎病毒持续的感染,但这些免疫细胞减少的机制还不十分清楚。近年发现,外周血淋巴细胞在被病毒、细菌感染或有丝分裂原等刺激发生增殖活化反应后是通过凋亡机制来清除的,这种现象被称为激活后诱导细胞凋亡(activation indu- ced cell death,AICD)。目前研究发现CHB患者的外周血淋巴细胞(periph- eral blood lymphocyte,PBL)经抗原刺激活化后发生AICD的比率比正常对照组高,提示HBV可能通过诱导PBL凋亡增多,造成免疫细胞减少而使其感染得以持续,所以由HBV所致的T细胞活化后诱导凋亡过多可能是乙肝慢性化重要的机制之一。许多研究已经证实在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells ,PBMC)表面死亡受体FasL和TRAIL较正常人是增加的,这可能是导致T细胞凋亡过多的原因之一。 线粒体途径是T细胞凋亡的另一种途径,主要通过Bcl-2家族的蛋白来调节。Bim蛋白是Bcl-2家族成员之一,只具有一个BH3结构域,可以通过拮抗Bcl-2等抗凋亡因子的作用或直接与Bax等相互作用来诱导凋亡,在维持中枢耐受和外周耐受中有很重要的作用。关于Bim蛋白是否参与了A- ICD过程,在国内研究很少。目前有研究表明在慢性免疫反应中,Fas和Bim共同调节T细胞的凋亡。为此我们通过体外模拟AICD的过程进一步探讨AICD发生的机制,为慢性乙肝肝炎的治疗提供理论依据。通过研究促凋亡蛋白Bim在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞激活诱导细胞凋亡中的表达,以及其与细胞凋亡的相关性,进一步探讨慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡增多的机制。 方法: 1入选标准和排除标准:选取慢性乙型肝炎患者共30例,其中男性16例,女性14例,年龄在18岁-55岁,平均年龄30岁,诊断标准符合2005年中华医学会制定的“慢性乙型肝炎防治指南,乙型肝炎标志物HBsAg阳性、HBeAg或抗-HBe阳性和抗-HBc阳性。排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIV感染,排除近3个月应用糖皮质激素、干扰素等影响免疫功能药物的患者,除外有近期急性感染患者。健康对照15例,男9例,女6例,年龄在18岁-50岁,平均年龄28岁,取自健康献血员。 2用RT-PCR定量检测HBV-DNA的含量。 3 PBMC提取和培养:无菌条件下抽取肝素抗凝血4mL,应用密度梯度离心法分离PBMC。分离成功的PBMC加入植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA)100μg/ml刺激培养16-18小时,弃去PHA,加入外源性IL-2 1000U/L进行培养至少7天后,用抗CD3抗体500ug/ml重新刺激48小时。 4细胞凋亡的检测 培养的细胞用70%乙醇固定,4℃离心去掉固定液,并用冷PBS洗2次,加入含有RaseA的PI染液约1000μL,室温静置30分钟后上流式细胞仪检测凋亡率。 5 Bim蛋白的检测 剩余细胞,提取蛋白后,-80℃保存,待收集够标本后集中行Western blot检测Bim蛋白的表达情况。 结果: 1经抗CD3抗体刺激48h后,慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞凋亡率(27.04%±6.91%)与健康对照组(19.87%±4.83%)比较差异有统计学意义(t=3.592,P0.01)。HBVDNA阳性组的PBMC的凋亡率(30.08%±8.25%)与HBVDNA阴性组(24.21%±5.38%)比较差异有统计学意义(t=2.745,P0.05)。 2在慢性乙型肝炎患者促凋亡蛋白Bim表达(0.99±0.33)与健康对照组(0.57±0.20)比较差异有统计学意义(t=4.588,P0.01)。HBVDNA阳性组的外周血PBMC的中Bim蛋白表达(1.16±0.33)与HBVDNA阴性组(0.82±0.21)比较差异有统计学意义(t=3.262,P0.01)。 3 PBMC中Bim表达与凋亡率成正相关(