绿原酸水解酶的发酵制备及其在葵花籽水媒法加工中的应用

作     者：胡梦姣 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张文斌

授予年度：2017年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 083202[工学-粮食、油脂及植物蛋白工程] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：绿原酸 绿原酸水解酶 ARTP诱变 葵花籽蛋白 水媒法 

摘      要：葵花籽蛋白质是一种高营养价值的优质蛋白资源,由于与葵花籽中绿原酸类物质相互作用而降低了感官品质和功能性质,从而限制其利用开发。现有物理化学脱酚方式仍无法实现葵花籽绿原酸的完全脱除。若能以酶催化水解方式去除绿原酸,将为脱除葵花籽中绿原酸引入新方法。绿原酸水解酶是能特异性催化水解绿原酸的一种酯酶,还具有酯化和转酯化活性。在制备咖啡酸和生物合成咖啡酸苯乙酯活性药物成分方面具有较大应用优势,而如今国内外仅有少量关于绿原酸水解酶的研究报道。本研究通过筛菌、诱变获得产绿原酸水解酶菌株,并分离纯化出绿原酸水解酶,将其应用于水代法制备葵花籽蛋白工艺中,研究了酶解绿原酸处理对葵花籽蛋白的影响。主要研究结果如下:首先,以绿原酸为唯一碳源,从富含绿原酸的葵花籽和金银花的种植地土壤中筛得产绿原酸水解酶,其中菌株SD-14酶活最高为0.048 U/mL。菌株鉴定其为黑曲霉,命名为Aspergillus niger SD14,ITS基因序列Genbank登录号为KY860764。为提高菌株产酶能力,采用了常温室压等离子体诱变方式对其快速诱变并对发酵条件进行优化。诱变得6株正突变株,其中菌株*** SD14.721酶活最高为0.081 U/mL,提高69%,遗传性稳定性良好。优化条件下发酵得到的绿原酸水解酶酶活力为0.139 U/mL,是优化前的1.72倍,是原始菌株2.90倍。其次,对发酵粗酶液采用超滤浓缩、硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF离子层析和Superdex G200凝胶过滤层析进行分离纯化,最终纯化后绿原酸水解酶比酶活4.35 U/mg。SDS-PAGE凝胶电泳检测单条带,相对分子质量约为96.7 k。进一步研究了纯化绿原酸水解酶的酶学性质,得出最适反应pH为7.0,最适温度为60℃。在pH 3.0.0范围内,具有较好的pH稳定性。60℃以上酶活稳定性变差。金属离子Cu、Fe、Al和Fe对酶活有明显抑制作用。绿原酸水解酶Km和Vmax分别为1.85μM和0.38μmol/min。随后,开展了绿原酸水解酶在葵花籽水媒法加工中的应用研究。以微酸脱酚处理后的葵花籽为原料,结合水代法提油工艺,添加自制绿原酸水解酶水解脱酚葵花籽中残余绿原酸,制得脱除绿原酸的葵花籽蛋白粉。初步确定了酶水解脱酚葵花籽中残余绿原酸的最佳工艺条件为:酶添加量1.0 U/g、酶解温度30℃、酶解3 h。在此条件下,残余绿原酸的水解率为93.09%。最后,利用自制绿原酸粗酶粉和含绿原酸水解酶活力的商品酶Cellulase A“Amano3分别制备了葵花籽蛋白粉。对比分析了未脱酚、脱酚、经绿原酸水解酶处理和商品酶处理所得到的四种葵花籽蛋白的色泽、体外消化率和溶解性、持水持油性、乳化稳定性等功能性质。两种酶解处理后葵花籽蛋白粉颜色由绿色变为浅灰色,感官品质提升,溶解性显著提高,分别为80.4%和87.7%,持水性和乳化稳定性显著上升,蛋白质体外消化率分别提高至88.79%和89.27%。氨基酸分析表明葵花籽蛋白氨基酸结构均衡,种类齐全,具有较高营养价值。