徐州猫源弓形虫株基因型及其毒力研究

作     者：朱长东 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：沈继龙

授予年度：2016年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：弓形虫 基因型 毒力 GRA15基因 ROP5基因 ROP16基因 ROP18基因 

摘      要：目的采集分离江苏徐州猫源弓形虫株,了解其基因型和毒力,分析基因型与毒力相关分子间的关系,为研究弓形虫致病机制奠定基础。方法自江苏徐州采集流浪猫40只,麻醉处死后取脑、舌、心等组织匀浆,消化过滤后制备成悬浆,腹腔注射接种昆明鼠,分离弓形虫;收集感染小鼠腹水,分离纯化出弓形虫速殖子,提取虫株基因组DNA,采用PCR-RFLP法对10个基因分型位点(SAG1、SAG2、SAG3、BTUB、GRA6、c22-8、c29-2、L358、PK1及Apico)进行PCR扩增,扩增产物用相应的限制性核酸内切酶水解后观察分析电泳图谱,与参考虫株对比,判定弓形虫株的基因型;将分离的虫株分离纯化的速殖子,按照1×103个/只小鼠的量,分别腹腔注射感染SPF级BALB/c小鼠和昆明鼠,每组10只小鼠,常规饲养并观察其存活时间,计算存活率,分析每个弓形虫株毒力的强弱;选取弓形虫致密颗粒蛋白GRAs家族和棒状体蛋白ROPs家族的毒力相关效应分子基因GRA15和ROP5、ROP16、ROP18,合成引物,PCR扩增出其基因序列,PCR产物测序后与基因库中的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型对比分析,比较其多态性。结果本次实验从徐州40只流浪猫共分离出6株弓形虫株,按照实验室的命名方式和猫的编号,分别为TgCtxz9, TgCtxz34, TgCtxz37, TgCtxz38, TgCtxz39, TgCtxz40,均以速殖子的形式存在,不形成包囊。RFLP-PCR基因分型的电泳结果显示,2株为Chinese 1型(即ToxoDB#9型),4株为ToxoDB#205型。此6株分离弓形虫虫株取1×103速殖子经腹腔接种BALB/c小鼠和昆明小鼠后,均表现出较强的毒性,BALB/c小鼠第5天开始出现竖毛、腹水、抽搐等明显症状,至感染后5-7 d完全死亡,昆明小鼠存活时间略长,但在9-12d亦100%死亡。PCR扩增6株弓形虫的毒力相关分子GRA15和ROP5,ROP16,ROP18,产物测序后与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型比对后发现,Chinese 1型2个虫株的上述4个分子的基因分别为GRA15Ⅱ型和ROP5μ-2型、ROP16Ⅰ/Ⅲ型、ROP18Ⅱ型,ToxoDB#205型4个虫株显示为GRA15Ⅱ型和ROP5μ-1型、ROP 16Ⅱ型、ROP18Ⅱ型,表现出在GRA15和ROP18两个因子上的一致性以及在ROP5和ROP 16上的明显的差异性。结论成功分离出江苏徐州猫源性弓形虫虫株6株,经RFLP-PCR基因分型显示其中2株为Chinese 1型(即ToxoDB#9型),4株为ToxoDB#205型,表明徐州地区猫源弓形虫虫株具有有限遗传多态性。分离的虫株通过感染BALB/c小鼠和昆明小鼠后,计算小鼠生存时间发现,两种基因型的6个弓形虫虫株均能在较短的时间内引起小鼠全部死亡,证实6个虫株均为强毒株。分离的两种基因型的毒力相关分子GRA15,ROP5,ROP16和ROP18的基因序列扩增测序证实,流行于我国的优势基因型Chinese 1型虫株,以及ToxDB#205型虫株,在此4种毒力相关分子的基因序列上,不同于传统的Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型虫株,提示有更多的因素参与作用,这一毒力相关基因的多态性与其毒力的关系尚待深入研究。