丁基苯酞对慢性脑缺血老龄大鼠海马APP表达的影响

作     者：王兴萍 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：卢宏

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：慢性脑缺血 丁基苯酞 老龄大鼠 海马 β-淀粉样前体蛋白(APP) 免疫组织化学 RT-PCR 免疫斑点 

摘      要：背景和目的：慢性脑缺血是神经系统的一种常见的病理状态，伴发于血管性痴呆(Vascular dementia，VD)、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)及Binswanger病等多种疾病的病理过程中，早期以认知功能损害为主要表现，最终导致持久或进展性认知与神经功能障碍，因此研究其发病机制对慢性脑缺血的临床防治具有普遍意义。慢性脑缺血的病理基础之一是大脑皮层及其它脑区出现大量β淀粉样蛋白质(β-amyloidprotein，Aβ)沉淀，Aβ是一种难溶性的蛋白质，一般由42(39～43)个氨基酸残基组成，分子量约为42kDa，由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，APP)水解产生，APP是一个很大的蛋白质分子，分子量为78kDa，APP基因约有170kb，含有18个外显子。丁基苯酞是从芹菜籽中提取出来的左旋体，后经人工合成为消旋体，经中国医学科学院药物研究所的科研人员20余年的研究证明，丁基苯酞对动物急性缺血性卒中具有多种机制的治疗作用，但是该药用于慢性脑缺血是否有效有待研究。海马是脑缺血最为敏感的部位，且位置特殊，与认知等有密切关系，海马CA1区与海马内部及海马外结构有广泛的纤维联络，是长时程增强(long-term potentiation，LTP)形成及学习、记忆的重要部位，因此选择了大鼠海马区作为研究对象。已有免疫组织化学研究发现，丁基苯酞可抑制皮层和海马的神经元变性、坏死，同时可减轻星形胶质细胞增生、活化，以及抑制少突胶质细胞减少，并能改善慢性脑缺血引起的认知功能障碍。有关丁基苯酞治疗慢性脑缺血对Aβ表达影响的研究目前国内外尚未见报道。本文旨在运用免疫组织化学法、RT-PCR法及免疫斑点法观测应用该药物干预后慢性脑缺血老龄大鼠海马区APP mRNA及蛋白水平的表达变化，进一步研究该药对慢性脑缺血干预作用的治疗机制，探讨该药在细胞学、分子生物学及蛋白水平的作用机制，可以让临床医生更准确地理解和把握该药的作用机制和临床适应症，为该药治疗慢性脑缺血提供理论依据。 材料和方法： 1．动物分组与模型制备： 试验动物选用健康Wistar大鼠150只(郑州大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，12-14月龄，体重450-550克。随机分为模型组(A)、假手术组(B)、预防组(C)、低剂量组(D)和高剂量组(E)，共5组，每组30只。假手术组仅暴露双侧颈总动脉而不结扎，余各组采用双侧颈总动脉结扎(2VO)法制备动物模型。C组先给予丁基苯酞***.d，1月后停药，行2VO术;B组正常饲养2月后仅给予安慰剂;A、D、E组行2VO术，正常饲养2月后，A组给予安慰剂，D组给予丁基苯酞***.d，E组给予丁基苯酞***.d，连续灌胃1个月;共3月后处死动物。 2．标本采集： ①免疫组织化学法标本采集：麻醉动物，37℃生理盐水灌洗后断头迅速取出脑组织，放入4％多聚甲醛中后4℃冰箱内固定24小时，经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制作脑部冠状石蜡切片(厚度3um)，以备免疫组化染色。 ②RT-PCR及免疫斑点法标本采集：麻醉动物，断头取血后迅速冰上分离脑组织，装入1.5ml EP管中，-80℃保存，以备RT-PCR及免疫斑点实验使用。 3．免疫组织化学法 ①抗体：一抗兔抗APP单克隆抗体 二抗HRP标记山羊抗兔多克隆抗体 ②免疫组织化学染色步骤：烘片、脱蜡至水、抗原修复、血清封闭、加一抗、加二抗、DAB显色、苏木素复染、分化、封片、照相;③图像分析 ***-PCR： ①组织总RNA提取：超低温冰箱取标本，迅速冰上分离，取出其中一侧海马，用Trizol法提取组织总RNA，测定样品中260nm、280nm吸收峰的OD值，鉴定RNA纯度和含量。 ②逆转录-聚合酶链反应： *引物β-Actin：5’GGGAAATCGTGCGTGACAT 3’ 5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG 3’ APP：5’GGGTCTGGGTTGACAAACATC 3’ 5’CATTCTGCTGCATCTTGGAGA 3’ * 25ul体系，50℃，15min，cDNA合成;94℃，2min，预变性;94℃，30s，变性;56℃，30s，退火;(经过反复试验确定最适退火温度为56℃) 72℃，1.5min，延伸;4℃，forever。 *琼脂糖凝胶电泳配制2％琼脂糖凝胶，10xBuffer上样，EB染色。 ③图象分析 5．免疫斑点实验： ①组织总蛋白提取：取另一半海马用单去污裂解液法提取组织总蛋白。 ②免疫斑点实验： *抗体一抗：小鼠抗大鼠IgG1 APP单克隆抗体 二抗：HRP标记羊抗小鼠IgG多克隆抗体 *步骤组织总蛋白液(即抗原液)按1：20稀释;在醋酸纤维素(nitroce