人肝癌耐药细胞株核酸适配体筛选及其性能研究

作     者：黄芝香 

作者单位：湖南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭秋平;王柯敏

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Cell-SELEX 肝癌耐药细胞株 核酸适配体 耐药蛋白 

摘      要：临床上化疗是中晚期肝癌综合性治疗的主要手段,但是肝癌细胞的耐药性严重阻碍了化疗的效果。及早的发现肝癌耐药细胞,研究引起肝癌耐药的相关分子及作用机制并逆转耐药,可以有效的降低耐药性,提高患者的治愈率。通过cell-SELEX技术可以在未知靶分子的情况下筛选获得特异性识别靶细胞的核酸适配体,为耐药细胞耐药相关物质的发现、癌症的临床诊断与分型、耐药机制研究以及逆转耐药性提供一个全新的思路和方法。因此,本文基于Cell-SELEX技术,以人肝癌耐药细胞为靶细胞,人肝癌细胞为对照细胞,筛选出一种能高亲和力高特异性识别人肝癌耐药细胞的核酸适配体,对其识别性能进行表征、初步研究应用以及探究耐药性相关性。具体内容如下:1.人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM核酸适配体的筛选以人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM为靶细胞,人肝癌耐药细胞株HepG2为对照细胞,利用Cell-SELEX技术,通过不断增加筛选压力从而提高筛选的效率,最后经过12轮筛选,获得了饱和富集筛选文库。通过对筛选文库进行克隆测序和同源性分析,挑选出了 4条最佳的序列H1、H2、H7和H13。并对挑选出的序列的选择性及亲和力进行考察最后获得了一条能特异性识别靶细胞的核酸适配体H1。2.人肝癌耐药细胞株核酸适配体的序列优化及初步应用研究运用Mfold软件分析了筛选获得的核酸适配体H1的二级结构并对其进行序列结构的优化,得到一条平衡解离常数约为7nM的序列d3,其碱基数仅有50nt。并通过流式细胞仪分析考察了优化后的核酸适配体的温度稳定性以及蛋白酶处理对其结合情况的影响等。实验结果表明,优化后的序列能高特异性、高亲和力的识别靶细胞,而且对温度有一定的耐受性,另外酶处理过的细胞对核酸适配体的结合有一定的影响,初步推测细胞表面的靶分子很可能是一种膜蛋白,为后续研究肝癌耐药细胞的耐药蛋白与耐药性质奠定了实验基础,并有望应用到耐药细胞的早期诊断与分子靶向治疗中去。3.人肝癌耐药细胞耐药性能及逆转耐药性研究通过流式细胞分析仪对核酸适配体结合的靶标与肝癌耐药细胞的耐药性能的关系进行了考察,包括结合位点、靶标以及与耐药细胞耐药性的关系,实验结果表明,核酸适配体与细胞结合的的靶标并不是耐药细胞膜上的Pgp耐药蛋白,但是其靶标跟耐药细胞的耐药性有关系,可能是耐药细胞上的另外一种耐药蛋白。同时,通过MTT实验考察了核酸适配体对耐药细胞耐药性的影响,结果显示,随着药物浓度的不断增加与核酸适配体结合的耐药细胞HepG2/ADM的存活率相对于随机序列由85%逐渐降低到64%左右,而对于对照细胞结合核酸适配体或随机序列时随着药物浓度的不断增加其细胞存活率几乎没有发生改变,由此推测核酸适配体与细胞结合对耐药细胞的耐药性产生了影响,能够降低细胞的耐药性,这为逆转耐药细胞的耐药提供了新的方法,对耐药细胞的治疗产生了积极的影响