肝癌干细胞表面标志物CK19、CD90在化学诱癌过程中不同阶段的差异表达

作     者：张珍妮 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：匡志鹏

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝癌 干细胞 CK19 CD90 C57BL/6J 小鼠 

摘      要：目的检测肝癌干细胞标志物CK19、CD90在联用DEN/CCl4/Ethanol化学诱发C57BL/6J小鼠肝癌过程中不同阶段的表达,从而说明肝癌干细胞表面标志物CK19、CD90在肝癌形成过程中的不同调控作用,并推测肝癌干细胞在肝癌形成过程中可能的作用机制。方法全部小鼠按照随机数字表法分为实验组和对照组,分笼饲养,标准化光照和自由进食及饮水。实验组为50只C57BL/6J雄性小鼠,通过联用DEN/CCl4/Ethanol化学法诱发肝癌,对照组为50只C57BL/6J雄性小鼠,仅以正常小鼠颗粒饲料喂养,并自由饮用灭菌普通水。观察小鼠的一般生长情况,每2周从实验组和对照组随机各抽取5只小鼠,处死后打开腹腔,观察肝脏表面情况,并摘取肝脏以获取小鼠肝组织标本（实验组中主要是切取含可疑病变的肝组织做标本）,进行病理学、RT-PCR、荧光实时定量PCR（FQ-RT-PCR）法、Western Blot流式细胞术等检测CK19、CD90基因及蛋白的表达情况。结果联用DEN/CCl4/Ethanol化学诱发C57BL/6J小鼠肝癌,整个诱癌过程中实验组和对照组小鼠均未出现小鼠死亡：现象,至诱癌第20周时,留存的实验组小鼠成瘤率100%。对照组小鼠生长状况良好,体重随着周龄增长而增加,平均体重由16g左右增加到30g左右,肝脏颜色红润,被膜光滑,质软,边缘较锐利,无结节;实验组小鼠活动减少,到化学诱癌第18周之后体重开始呈下降趋势,平均体重从29g下降到26g左右,化学诱癌第14周之前,肝组织被膜较光滑,颜色暗红,质地较软,HE染色病理结果,主要表现为肝脏的充血水肿,部分肝细胞变性坏死,炎症细胞浸润,并伴有部分肝细胞增生,呈药物性肝炎的表现,为慢性肝损伤期。化学诱癌第14周可见假小叶形成,间质有纤维组织增生,部分胆管上皮增生,并随着诱癌进展,肝细胞排列结构轻度紊乱,为肝硬化期。化学诱癌第16周处死的小鼠,肝脏表面出现明显的灰白色小结节,呈单发或者多发性,直径在1-3mm,镜下见肝细胞增生结节,结节内肝细胞呈不典型性增生,为非典型增生期。化学诱癌第18、20周时肝癌结节直径在5mm左右,呈多发性;病理切片显示为高、中分化的肝癌细胞,可见瘤巨细胞和病理性核分裂,为癌变期。RT-PCR, Western Blot定性和FQ-RT-PCR、流式细胞术定量的结果显示,在实验组和对照组间及诱癌不同阶段,CK19基因及蛋白在实验组诱癌第14周时开始低水平表达,诱癌第16周表达水平升高,诱癌第20周时显著高于对照组和早期实验组,（P0.05）;在实验组和对照组之间以及诱癌不同阶段CD90基因和蛋白表达水平的比较,均在诱癌第16周后开始出现表达差异,诱癌第20周时表达差异更明显（P0.05）,综上所述,与正常对照组比较,实验组CK19、CD90基因和蛋白的表达在诱癌不同的阶段存在差异表达,而且分别在化学诱癌第14周和第16周后出现表达,并且表达水平随着诱癌时间递增而逐渐升高,至诱癌第20周时均呈明显高表达。结论1、诱癌过程中无小鼠死亡,至诱癌第20周时,留存的小鼠成瘤率100%,病理学类型为中分化或者高分化肝细胞癌。2、定性和定量检测CK19基因和蛋白,在化学诱癌第14周后开始低水平表达,诱癌第16周后表达水平升高,诱癌第20周时高表达,与对照组和早期实验组比较有显著性差异,提示CK19在肝癌发生、发展过程中存在差异表达。3、定性和定量检测CD90基因和蛋白,在化学诱癌第16周后开始表达并呈现逐渐增高的趋势,至诱癌第20周时表达水平明显增高,与对照组和其他诱癌阶段实验组比较有明显差异,提示CD90的表达在化学诱导肝癌过程中呈动态变化。4、CK19和CD90基因和蛋白在诱癌过程中开始表达出现的时间差异,说明二者对肝癌形成过程的不同阶段发生不同的调控作用,二者的具体调控机制及有关信号通路的调控情况将在下一步进行深入研究。