稳定转染重组14-3-3σ基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

作     者：郝苗 

作者单位：辽宁医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：齐凤杰

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：14-3-3σ 乳腺癌MCF-7细胞 真核表达载体 转染 

摘      要：目的 鉴定人源性14-3-3σ真核表达载体pEGFP-GV142-SFN。将真核表达载体转染乳腺癌MCF-7细胞(Breast cancer cell line MCF-7)，筛选出稳定表达14-3-3σ基因的细胞系，进一步探讨14-3-3σ作用于MCF-7细胞增殖的可能机制，以寻找抑制乳腺癌增殖的新方法，为组织水平和动物水平评价14-3-3σ的生物学功能、筛选临床基因治疗乳腺癌的优选靶基因提供实验依据。 方法 1、重组表达质粒pEGFP-GV142-SFN经琼脂糖电泳初步分析及酶切鉴定后,送上海吉凯测序。脂质体Lipofectamine2000介导测序正确后扩增且用去质粒抽提试剂盒提取出的质粒转染MCF-7细胞,G418筛选出稳定表达14-3-3σ的MCF-7细胞系;2、实验分三组：pEGFP-GV142-SFN实验组、pEGFP-N1对照组及乳腺癌MCF-7细胞正常情况下14-3-3σ表达抑制的空白对照组。检测转染细胞中14-3-3σ基因mRNA情况使用RT-PCR法，检测蛋白表达情况用Western blot方法，观察细胞增殖状态使用MTT法。 结果 1、真核表达载体pEGFP–GV142-SFN的鉴定：重组质粒pEGFP–GV142-SFN用限制性内切酶BamH I和HindⅢ双酶切，得到一条774bp的目的条带。证明目的基因已正确插入质粒GV142，得到了真核表达载体。pEGFP-GV142-SFN所获质粒经上海生工生物工程技术服务有限公司测序，并与GenBank公布的序列(NM06142.3)比对,同源性100%，无碱基突变。 2、建立稳定转染乳腺癌MCF-7细胞系： pEGFP-GV142-SFN实验组、pEGFP-N1对照组观察到转染后有绿色荧光蛋白的表达，G418(700μg/mL)筛选细胞阳性克隆，扩增培养即为稳定表达14-3-3σ的乳腺癌MCF-7细胞系,命名为MCF-7-GV142细胞。 3、三组MCF-7细胞Western blot：14-3-3σ蛋白表达量在实验组明显高于对照组和空白组，存在着显著性差异(P0.01);而阴性对照组、空白对照组之间14-3-3σ蛋白表达量无明显差异(P0.1)。 4、三组MCF-7细胞进行RT-PCR结果表明：实验组细胞内14-3-3σmRNA表达量明显高于其他两组，存在显著性差异(P0.01);而阴性对照组与空白对照组细胞内14-3-3σmRNA表达量之间无明显差异(P0.1)。 5、三组MCF-7细胞进行MTT法检测结果表明：实验组细胞对数时间的增殖情况明显低于其他组(P0.01)，且抑制效应随着时间的延长而愈发明显;而阴性对照组与空白对照组之间细胞对数时间的增殖情况无明显差异(P0.1)。 结论 1、成功鉴定14-3-3σ基因重组表达载体pEGFP-GV142-SFN;2、G418筛选出稳定表达14-3-3σ基因的乳腺癌MCF-7系;3、重组真核表达载体pEGFP-GV142-SFN增强乳腺癌MCF-7中14-3-3σ基因的mRNA和蛋白的表达;4、重组真核表达载体pEGFP-GV142-SFN能显著抑制乳腺癌MCF-7的增殖。