乳腺癌细胞内Mfn2基因沉默的表观遗传学机制的研究

作     者：洪慧 

作者单位：华北理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张景华;李玉凤

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：乳腺癌 MCF-7细胞 Mfn2基因 DNA甲基化 5-氮杂-2’-脱氧胞苷 甲基化特异性PCR 

摘      要：目的本研究通过解析Mfn2基因启动子区甲基化状态对其表达水平及细胞生物学特性的影响,旨在探讨在人乳腺癌细胞中Mfn2基因沉默的表观遗传学机制,为乳腺癌发病机制的理解及Mfn2基因作为乳腺癌治疗新靶点提供表观遗传学依据。方法1实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法检测人乳腺癌细胞系MCF-7细胞和正常乳腺细胞系HBL-100细胞,及乳腺癌及癌旁组织中Mfn2 m RNA的表达水平;2采用甲基化特异性PCR(MSPCR)法检测MCF-7细胞和HBL-100细胞,及乳腺癌及癌旁组织中Mfn2基因启动子区甲基化状态;3不同浓度甲基化酶抑制剂5-aza-Cd R处理MCF-7细胞5天后,MSPCR法检测Mfn2基因启动子区甲基化的变化情况;RT-q PCR法检测Mfn2 m RNA表达水平的变化情况;细胞免疫化学染色法和western blot法检测Mfn2蛋白的表达水平变化情况;4不同浓度5-aza-Cd R处理MCF-7细胞1-5天内,MTT法检测MCF-7细胞生长增殖的变化情况;流式细胞术检测MCF-7细胞增殖及细胞周期的变化情况;倒置显微镜下观察MCF-7细胞的形态学变化。结果1与HBL-100细胞相比,MCF-7细胞中Mfn2 m RNA呈低水平表达,两者相比差异有统计学意义(P0.05);与对应的癌旁组织相比,7例乳腺癌组织中Mfn2 m RNA表达水平均较低,两者相比差异有统计学意义(P0.05);2与HBL-100细胞相比,MCF-7细胞中Mfn2基因启动子区呈高甲基化状态;7例癌旁组织中1例发生了甲基化,甲基化率为14.3%,7例乳腺癌组织中有6例发生了甲基化,甲基化率为85.7%,与癌旁组织的甲基化率相比有显著性差异(P0.05);3经5-aza-Cd R处理的MCF-7细胞内Mfn2基因启动子区甲基化水平降低,且呈浓度依赖趋势;经5-aza-Cd R处理的MCF-7细胞内Mfn2 m RNA和蛋白水平增高,亦呈浓度依赖趋势;4经5-aza-Cd R处理的MCF-7细胞,细胞的生长受到抑制;细胞周期阻滞在G2/M期;细胞的形态发生明显变化,细胞变圆、伸出伪足,甚至出现空泡、凋亡。这些生物学特性的改变呈浓度和时间依赖趋势。结论Mfn2基因启动子区的甲基化可能是其在乳腺癌细胞内沉默的重要表观遗传学调控机制。去甲基化处理可促进Mfn2的转录,提高m RNA和蛋白水平,进而抑制乳腺癌细胞增殖。本实验为将Mfn2作为治疗乳腺癌的新靶点提供了表观遗传学依据。