羊微孢子虫病流行病学调查及分子特征初步研究

作     者：李梦婕 

作者单位：河南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宁长申

授予年度：2012年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：羊 微孢子虫病 感染 流行病学 16S核糖体RNA基因 巢氏PCR 种系发育 

摘      要：微孢子虫是一种专性细胞内寄生的真核单细胞寄生物,能够感染多种无脊椎动物和脊椎动物。首例微孢子虫感染于1857年在家蚕体内发现,首例哺乳动物感染微孢子虫于1922年在兔体内发现,1959年发现首例人微孢子虫感染,1985年首次在AIDS病人体内发现微孢子虫感染。随后,微孢子虫感染哺乳动物(包括人)的报道越来越多,迄今已知有至少8个属14种微孢子虫可以感染人,其中比氏肠微孢子虫(Entercytozoon bieneusi)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、肠脑炎微孢子虫(E. intestinalis)和海伦脑炎微孢子虫(E. hellem)是最常见的人兽共患微孢子虫。微孢子虫作为一种重要的人兽共患寄生虫,已引起了研究者们的广泛关注。近年米,有关微孢子虫感染动物及人的报道越来越多。微孢子虫感染免疫缺陷的人或动物主要引起慢性、持续性腹泻,逐渐消瘦,严重者甚至导致死亡;感染免疫功能止常的人或动物主要引起急性、自限性腹泻或呈隐性感染;此外微孢子虫可以感染人的眼部引起角膜结膜炎等症状。国内外关于人以及猪、牛等其他动物感染微孢子虫的报道较多,而关于羊微孢子虫病的报道很少见。近年来,河南省养羊业的规模逐渐扩大,为了解我省部分地区羊微孢子虫病的流行情况,为微孢子虫病的防治及今后的研究提供参考依据,对我省部分地区的羊群进行了微孢子虫感染情况调查及分子特征的初步研究。 1、为了解我国部分地区绵羊肠道寄生虫病的感染及危害情况,科学地制定防治计划,合理指导动物肠道寄生虫病的防治工作,于2011年3月—2012年2月对河南省6个地区(郑州、登封、安阳、洛阳、三门峡、商丘)及吉林双辽、辽宁朝阳、山东东营等地的1109只绵羊进行直肠采集粪便样品,应用卢戈氏碘液染色法、饱和蔗糖溶液漂浮法和麦克马斯计数法等方法对所有样品进行检查,结果1078份样品查到不同种寄生虫感染,总感染率为97.20%：共查到球虫、隐孢子虫、贾第虫、鞭虫、细颈线虫、圆线虫、莫尼茨绦虫、矛形双腔吸虫、阿米巴等9种(类)肠道寄生虫,其中球虫感染率最高,为93.51%;寄生虫混合感染情况较普遍,80.70%(895/1109)的绵羊混合感染2-5种寄生虫,其中以混合感染2种和3种寄生虫的所古比例最高,分别为41.90%和44.47%。 2、据报道,可感染羊的微孢子虫有3种,分别为比氏肠微孢子虫(E. bieneusi)、兔脑炎微孢子虫(E. cuniculi)肠脑炎微孢子虫(E. intestinalis)。为了解河南省部分地区羊微孢子虫的感染情况及虫体的形态特征,用韦伯氏铬变素2R染色法对2011年7月-2011年12月采自河南省六个地区的802只羊的新鲜粪便样品进行检查,结果检出15份阳性样品,检出率为1.78%。染色后观察到微孢子虫孢子呈卵圆形,被染成粉红色,中间部分有带状结构,粪渣、细菌等杂质被染成绿色,易于区别。为确认羊微孢子虫感染率及感染的微孢子虫种类,合成三对种特异性引物,用巢氏PCR对802份粪便样品进行检测。结果检出23份阳性样品，感染率为2.87%,基因片段长607bp,均为比氏肠微孢子虫。不同品种、年龄的羊及不同季节、不同饲养方式饲喂的羊,微孢子虫感染率存在差异,绵羊感染率(3.90%)高于山羊(1.47%);幼龄羊感染率(3.16%)高于成年羊(2.44%);7-9月羊感染率(4.59%)高于10-12月羊(0.82%);放牧羊感染率(4.55%)高于舍饲羊(1.94%)。 3、为研究河南省部分地区羊感染的微孢子虫分子特征,对PCR检出的23个阳性样品进行测序,将测序所得序列在Genbank中BLAST比对后,下载得到的14序列,应用Clustal X1.81、 Phyloip3.64、DNAstar4.0等生物信息学软件对15个序列进行比对、同源性分析及构建分子发育进化树。发现本次调查得到的分离株(JQ769381)与分离自AIDS病人的比氏肠微孢子虫序列(AF024657)同源性高达100%,证实羊感染的微孢子虫均为比氏肠微孢子虫。JQ769381与分离自猕猴的比氏肠微孢子虫序列(AF023245)和分离自原牛的比氏肠微孢子虫(AY257180)均只有1个碱基的差异,同源性高达99.8%;JQ769381与分离自艾滋病人的比氏肠微孢子虫序列(AY298728和AY315717)有4个和5个碱基的差异,同源性达99.3%和98.7%;JQ769381与分离自猎鹰的比氏肠微孢子虫序列(DQ793212)有14个碱基的差异,同源性达97.5%;JQ769381与分离自艾滋病人的比氏肠微孢子虫序列(AH012971)有21个碱基的差异,同源性达95.5%。 本研究首次对河南省部分地区羊的微孢子虫病流行情况进行了调查,并初步研究了其分子特征