八肽胆囊收缩素对高糖所致大鼠视网膜色素上皮细胞损伤的干预作用

作     者：郝珍珍 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郝丽娜

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 100212[医学-眼科学] 10[医学] 

主      题：八肽胆囊收缩素 大鼠视网膜色素上皮细胞 氧化应激 糖尿病视网膜病变 老年黄斑变性 

摘      要：目的：糖尿病（diabetes mellitus, DM）作为一种人们熟知的代谢性疾病，随着国家的发展以及人们生活方式的改变，已经成为导致人类死亡的第三大原因。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy, DR）作为糖尿病眼部病变最严重的并发症，导致了每年不可逆的视力丧失的人数持续上升。其中老年黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）成为老年人群视力丧失的最常见原因，在65岁以上的老年人中，每3个人中就会有一个受到AMD的影响。而国内外许多实验研究以及临床试验都显示：氧化应激以及炎症已经成为AMD发生发展的两大非常重要的原因。而视网膜本身也容易受到氧化应激的影响，原因是代谢旺盛的视网膜的氧消耗量远远高于机体其他任何组织，多不饱和脂肪酸易被氧化且会激发具有细胞毒性的连锁反应。当前已经有大量的研究显示：应用高糖培养基刺激视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial, RPE），模拟糖尿病时RPE细胞在体内的高糖环境，造成细胞的氧化应激状态，并应用药物进行干预，结果显示高糖使细胞的活力下降，使一些细胞因子、炎性因子的表达发生变化，对RPE细胞造成损伤。本实验应用不同浓度的八肽胆囊收缩素（Cholecystokinin octapeptide，CCK-8)作用于高糖培养的大鼠RPE细胞，培养48小时后，MTT法检测细胞活力以及NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、及IL-6的表达的变化，根据结果筛选出CCK-8合适的治疗浓度，观察此浓度作用RPE细胞24小时、48小时及72小时上述因子的表达变化。 方法： 1筛选CCK-8治疗浓度：培养大鼠RPE细胞，取对数生长期细胞进行实验，随机分为8组：①正常对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L）②高糖组（葡萄糖浓度：30mmol/L）③高渗对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L）④高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-5mmol/L）⑤高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-6mmol/L）⑥高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-7mmol/L）⑦高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-8mmol/L）⑧高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-9mmol/L），各组细胞应用同种培养液培养24小时后换成条件培养液，继续培养48小时，倒置显微镜下观察细胞形态，应用MTT法检测不同浓度CCK-8对细胞活力的影响，同时收集细胞标本，进行RT-PCR实验，检测NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6表达的变化。 2不同时间段CCK-8治疗浓度10-6mmol/L相关因子变化：根据MTT及RT-PCR的结果得出CCK-8的治疗浓度为10-6mmol/L，再次分组：①正常对照组（葡萄糖浓度：5.56mmol/L）②高糖组(葡萄糖浓度：30mmol/L)③高渗对照组(葡萄糖浓度：5.56mmol/L+甘露醇：24.44mmol/L)④高糖+CCK-8治疗组（葡萄糖浓度：30mmol/L+CCK-8浓度：10-6mmol/L），各组细胞分别培养24小时、48小时、72小时，取相应时间段细胞标本进行RT-PCR检测上述7种因子表达。 结果： 1MTT法检测结果：与正常对照组比较，高糖组细胞的活力明显降低（P0.05），高渗对照组细胞活力未见明显改变;各不同浓度治疗组的细胞活力低于正常对照组，具有明显差异（P0.05），CCK-8浓度为10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三组之间细胞活力无明显差异，三组与高糖组相比无明显差异，CCK-8浓度为10-6mmol/L与10-5mmol/L两组之间细胞活力无明显差异，但要高于其他三组治疗组和高糖组（P0.05）。 2筛选CCK-8治疗浓度阶段RT-PCR结果：与正常对照组比较，高糖组NRF2、SOD1、γ-GCS、NQO1、TNF-α、IL-1α、IL-6的表达上升（P0.05），高渗对照组的表达未见明显差异。各不同浓度治疗组与正常对照组相比，其中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表达明显上升（P0.05），TNF-α、IL-1α及IL-6的表达明显下降（P0.05）。与高糖组相比，CCK-8浓度为10-7mmol/L、10-8mmol/L、10-9mmol/L三组中NRF2、SOD1、γ-GCS及NQO1的表达上升（P0.