文殊兰提取物抗癫痫及开放KCNQ型钾离子通道作用的研究

作     者：陈百灵 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：贾庆忠

授予年度：2018年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：文殊兰提取物 石蒜碱 HPLC KCNQ通道 MES和MMS癫痫模型 

摘      要：第一部分文殊兰提取物的制备及主要活性成份石蒜碱的含量测定目的:制备文殊兰提取物并检测其中主要生物碱的含量。方法:1文殊兰提取物的制备:文殊兰干燥鳞茎,粉碎后用95%的乙醇渗漉提取,提取液减压浓缩,浸膏部分分别用乙酸乙酯、二氯甲烷和石油醚萃取,并对乙酸乙酯提取物进行药效学及机制研究。2石蒜碱含量的测定:用高效液相色谱法(HPLC),经Phenomenex C18柱分离,流动相为水和1%三乙胺的甲醇溶液,等度洗脱。结果:1.01 kg文殊兰干燥鳞茎经分离提取后,乙酸乙酯部分得到浸膏1.6 g,经测量,此浸膏中石蒜碱含量为6.0%。小结:文殊兰提取物乙酸乙酯部分含有石蒜碱,含量为6.0%。第二部分文殊兰提取物抗癫痫作用观察目的:在电刺激和戊四唑诱导的癫痫动物模型上,观察文殊兰提取物抗癫痫作用。方法:1最大电休克刺激试验(maximal electroshock seizure model,MES):将预筛出的100只昆明小鼠随机分为5组,每组20只,文殊兰提取物分17.2 mg/kg(折合生药量为10.86 g/kg),33.4 mg/kg(折合生药量为21.72g/kg),66.8 mg/kg(折合生药量为43.43 g/kg)三个剂量组,阳性对照药为瑞替加滨(Retigabine,RTG)25 mg/kg,溶剂对照组给予0.5%CMC-Na,以上各组均灌胃给药。文殊兰提取物和CMC-Na灌胃后1 h,RTG灌胃后15 min,用YLS-9A型电子刺激仪,测定药物抗强直性惊厥发作百分率(或最大电休克保护率)作为评价指标。2戊四唑致癫痫试验(metrazol maximal seizure model,MMS):昆明小鼠100只,按照MES实验中的方案分组,单次灌胃给药,于颈背部皮下注射戊四唑(85 mg/kg),记录30 min内出现全身阵挛症状的时间和动物数量,比较癫痫大发作阈值和不发作的动物比例,作为药物保护作用的评价指标。结果:1在MES试验中,药物抗癫痫保护率,RTG组为85%,文殊兰提取物低、中、高三个剂量组分别为25%、35%、60%。与溶剂组(0%)相比,文殊兰提取物三个剂量组的保护率均可显著提高(P0.05,P0.01)。2在MMS试验中,动物出现癫痫大发作时的阈值,与溶媒组(8.7 min)相比,高剂量组(15.7 min)和阳性对照组(20.2 min)显著延长发作阈值(P0.05,P0.01)。药物抗癫痫保护率,文殊兰提取物低中高三个剂量分别为25%、30%、35%,RTG组为50%,与溶剂组(5%)相比,中、高剂量组的保护率明显提高(P0.05)。小结:文殊兰提取物在MES模型小鼠上有显著抗癫痫作用,对MMS模型小鼠在中、高剂量下也有一定抗癫痫作用。第三部分文殊兰提取物及石蒜碱对KCNQ2通道的影响目的:观察文殊兰提取物及主要成份石蒜碱对KCNQ2通道电流的影响。方法:1构建慢病毒载体p LV-KCNQ2感染CHO细胞,通过puromycin筛选KCNQ2基因过表达稳定细胞株,Realtime PCR检测目的基因表达。2在稳定表达KCNQ2通道的CHO细胞系上,用全细胞膜片钳方法观察1.5 mg/L,5 mg/L,15 mg/L的文殊兰提取物对该通道电流的影响。3在稳定表达KCNQ2通道的CHO细胞系上,用全细胞膜片钳技术观察0.1μM/L、1μM/L、3μM/L、10μM/L、30μM/L和100μM/L石蒜碱对通道电流的影响。结果:1 Realtime PCR检测目的基因过表达倍数3.8×107,功能学检测通道各项电生理参数与文献报道一致。2文殊兰提取物浓度依赖性地增强KCNQ2通道电流,并使激活曲线左移,15 mg/L的文殊兰提取物可使通道电流增加到给药前的1.31±0.03倍;通道半激活电压变化值(△V1/2)达14.2 m V。并且伴随通道动力过程明显改变,KCNQ2通道激活的τact.值明显缩短,失活的τdeact.值显著延长。3提取物中主要成份石蒜碱可浓度依赖性地增大KCNQ2通道电流,100μM/L可使电流增加到给药前的1.55±0.04倍,半数有效浓度(EC50)为5.24μM。通道的激活曲线浓度依赖性地左移,100μM/L浓度下,△V1/2值为26.4 m V。并且石蒜碱可使KCNQ2通道激活的τact.明显缩短,失活的τdeact.明显延长。小结:文殊兰提取物及所含主要成份石蒜碱可浓度依赖性地增强KCNQ2通道电流,并改变通道动力学过程,使激活曲线左移,加快激活,减慢去活。结论:文殊兰提取物表现出明显的抗癫痫作用,其主要成份石蒜碱含量为6.0%。文殊兰提取物乙酸乙酯部分和石蒜碱均可明显地开放KCNQ2通道,提示文殊兰的抗癫痫活性可能与其所含的石蒜碱增强KCNQ通道功能有关。