DNA核酶滚环扩增及金属纳米簇传感方法研究

作     者：李盼盼 

作者单位：长沙理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何婧琳;曹忠

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 070302[理学-分析化学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0703[理学-化学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：功能核酸 滚环扩增 DNA银纳米簇 铜离子 S1核酸酶 L-半胱氨酸 荧光光谱分析 

摘      要：随着科学研究的快速发展,功能核酸的发现使人们的视野得到了拓宽,使人们对核酸只作为载体用来转运和存储遗传信息的的传统观念得以打破,使人们对核酸的理解进一步加深,并且为研究生物分子领域提供了一种新的活性物质。同时,由于具有容易操作、特异性强和高的灵敏度等优点,滚环扩增技术已经受到人们的广泛关注。利用单链DNA稳定的荧光银纳米簇,由于具有良好的光学和光物理特性,近年来已发展成为常用的纳米荧光探针。本文借助DNA核酶分子机器及滚环扩增反应,并结合银纳米簇等荧光纳米探针技术,以铜离子、核酸酶及氨基酸为检测对象,开展以下主要工作:构建了一种以DNA核酶分子机器及滚环扩增反应为基础的荧光法用于铜离子(Cu)的定量检测。在无铜离子的情况下,模板链竞争夺取核酶底物链进行互补配对,当存在*** DNA连接酶时,使模板链连接成环,继而以底物链作为引物,当存在phi29 DNA聚合酶时,可以引发滚环扩增反应(RCA),产生长的DNA链产物,可杂交事先设计好的分子信标,继而使体系产生强的荧光信号。当存在铜离子时,铜离子诱发DNA核酶底物链的断裂,断裂的底物链无法在*** DNA连接酶存在时,使模板链连接成环,继而不能使RCA有效进行,最终导致体系的荧光信号大幅度降低。此传感器在Cu含量1 nMμM范围内产生优良的线性响应性能,R=0.9947,计算得出可检测铜离子的最低含量为0.6792nM。该方案有很好的反应效益比,开拓采用DNAzyme分子机器及滚环扩增反应用于有效测试金属离子含量的生物传感器的新思路。以单链DNA稳定的银纳米簇作为功能化探针,开展了一种无标记荧光法来对核酸酶(S1)进行定量检测。由于核酸酶(S1)可以特异性识别单链DNA,在最佳的环境条件下,可将其降解为单核苷酸或寡核苷酸片段。当体系中有核酸酶(S1)存在时,作为模板的单链DNA被特异性识别并降解,导致荧光银纳米簇无法合成,致使体系的荧光强度信号降低。从实验结果可以看出,在核酸酶(S1)含量持续增加时,银纳米簇的荧光信号强度不断降低。在最优的实验条件下,体系的信号参数(F/F)与S1核酸酶的含量在5×10×10 U/μL范围内呈线性关系,检出限为2×10 U/μL。该方法在RPMI 1640细胞培养基中得到的回收率为91.75%09.5%,因此该方法对样品中S1核酸酶的检测具有一定的可行性。以DNA为模板合成银纳米簇,且在L-半胱氨酸(L-Cys)的存在下,L-Cys中的巯基(SH)夺取C-Ag-C中的Ag,使得无法形成银纳米簇从而银纳米簇的荧光信号降低,进而实现对L-Cys的定量检测。在最优的实验条件下,L-Cys含量的对数值与该传感体系的荧光信号强度在2 nM0μM范围内呈现出较好的线性响应关系,计算得出检测下限为0.2 nM。该传感检测体系在干扰性考察中表现出好的选择性,并且还可用来检测实际样品。