内皮素3（EDN3）对羊驼皮肤黑色素细胞增殖和黑色素生成的影响

作     者：白俊明 

作者单位：山西农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：耿建军

授予年度：2013年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：黑色素细胞 羊驼 皮肤 内皮素-3(EDN3) 内皮素受体B(EDNRB) 酪氨酸激酶受体(KIT) 小眼相关转录因子(MITF) 酪氨酸酶(TYR) 黑色素 

摘      要：哺乳动物黑色素细胞生成的黑色素的数量、种类以及分布情况决定毛色。内皮素(EDN)是一类强大的促分化剂和细胞生长因子,具有促进细胞有丝分裂的作用。EDN3在来源于神经嵴细胞前体的黑色素细胞发育过程中发挥着重要的作用,对成黑细胞、黑色素细胞和黑素瘤细胞有许多作用。但在黑色素细胞内以EDN3表达为基础的机制我们知之甚少。本研究通过添加不同浓度EDN3于体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中,研究EDN3对羊驼黑色素细胞内相关基因的表达以及黑色素含量生成的影响,以揭示EDN3在黑素生成过程中的作用机理。本实验在原代培养的第4代羊驼皮肤黑色素细胞的培养基中添加不同浓度EDN3(10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L)。添加EDN372h后,主要内容和实验结果如下： 1.对照组羊驼皮肤黑色素细胞呈双树突或三树突形态而且树突的数目较少。而添加EDN3的实验组与对照组相比,细胞数量增多,突触数量增多,细胞的胞质也变大,以10-8mol/L组的细胞数量明显增多。 2.采用四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)检测羊驼皮肤黑色素细胞的增殖情况。结果显示：与对照组相比,添加的EDN3浓度在10-9mol/L时即可刺激黑色素细胞的增殖,10-8mol/L时达到最大效果(P0.05),在10-7mol/L时增殖的效果反而下降,即10-8mol/L为EDN3促增殖的最大效应剂量。 3.实时荧光定量PCR技术检测EDNRB、KIT、MITF、TYR基因mRNA的表达水平。结果显示：EDN3在10-8mol/L时黑素细胞中EDNRB基因mRNA表达水平是对照组的3.21倍;KIT基因mRNA表达水平是对照组的3.58倍;MITF基因mRNA表达水平是对照组的3.08倍;TYR基因mRNA表达水平是对照组的2.63倍(P0.05)。 4. Western Blot检测EDNRB、KIT、MITF和TYR蛋白表达的结果显示：与对照组相比,EDN3在10-8mol/L时蛋白表达量增加最为显著。与对照组相比,实验组EDNRB、 KIT、MITF和TYR蛋白表达量分别是对照组的2.34倍,2.22倍,3.46倍,1.59倍(P0.05)。 5.紫外分光光度法测定羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的含量。结果显示,与对照组相比添加浓度在10-8mol/L时黑色素合成达到最大效果,黑色素产量为对照组的1.44倍(P0.05) 上述结果揭示EDN3可以促进羊驼皮肤黑色素细胞的增殖,能上调细胞内EDNRB、 KIT、MITF和TRY在转录水平和蛋白水平的表达从而上调黑色素细胞合成黑色素。