笛鲷属鱼类视蛋白基因的进化与表达分析

作     者：刘雪媚 

作者单位：广东海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘楚吾;郭昱嵩

授予年度：2013年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：笛鲷属 视蛋白基因 系统进化 荧光定量PCR 

摘      要：笛鲷属（Lutjanus）鱼类隶属于鲈形目（Perciformes），广泛分布于热带和亚热带，是我国南海海区捕捞和养殖的重要对象。本文从视蛋白基因的分子系统进化、基因序列分析及表达分析三个方面来阐述笛鲷属鱼类的种系发生过程、视蛋白基因序列结构及其表达情况。主要结果如下： 1.获得10种笛鲷属鱼类（红鳍笛鲷（Lutjanus erythopterus）、千年笛鲷（L. sebae）、勒氏笛鲷（L. russellii）、约氏笛鲷（L. johnii）、金带笛鲷（L. fulvus）、金焰笛鲷（***）、画眉笛鲷（L. vitta）、奥氏笛鲷（L. ophuysenii）、紫红笛鲷（***）、星点笛鲷（L. stellatus））的RH（Rhodopsin）、SWS1（Shortwavelength-sensitive pigment）和SWS2a（SWS1-like pigment）基因部分区段，并构建分子系统进化树，结合COⅠ条形码数据，分析笛鲷属鱼类的种系发生历程。三种视蛋白基因构建的系统进化分析表明画眉笛鲷和奥氏笛鲷，红鳍笛鲷和千年笛鲷具有紧密的亲缘关系。此外，在RH、SWS1和SWS2a基因片段中分别检测到16、2和9个氨基酸变化位点。 2.测定了红鳍笛鲷（L. erythopterus）LWS（Long wavelength-sensitive pigment）和RH基因的cDNA全长，其中1302bp的LWS基因cDNA全长包括：ORF的1074bp （编码一条具有357个氨基酸残基的多肽），5′端非编码区的15bp及3′端非编码区的213bp（含22bp的polyA）。而1497bp的RH基因的cDNA全长包括：ORF的1062bp（编码353个氨基酸残基），5′非编码区的60bp以及3′非编码区为375bp。此外，通过设计扩增LWS和RH基因ORF的引物，获得勒氏笛鲷，约氏笛鲷及金焰笛鲷LWS基因的ORF，勒氏笛鲷，约氏笛鲷，金焰笛鲷及画眉笛鲷RH基因的ORF。比对分析结果表明LWS基因和RH基因在笛鲷属鱼类中具有很高的相似性，分别为94%～99%和94%～98%。对LWS和RH基因的编码蛋白进行二级结构和三级结构的预测，表明其均为典型的膜蛋白，具有7次跨膜结构域，与其他脊椎动物的视蛋白结构一致。cDNA序列聚类分析表明，视蛋白基因的分子进化树与高级阶元的系统演化树较为吻合，支持视蛋白基因在高级阶元系统进化分析中的适用性。另外，在近缘物种间由于适应性的趋同进化影响明显，无法用于近缘种间物种树构建。 3.采用Real-time PCR技术，以β-actin和GAPDH基因为内参，探讨RH基因在红鳍笛鲷成体的心脏、肝脏、脾脏、胃、肌肉、脑、皮肤和视网膜8个组织的表达情况，结果表明RH基因在成体红鳍笛鲷视网膜中的表达量最高。分析视网膜中LWS、RH、SWS1和SWS2a基因在正常光环境与黑暗处理后的表达差异，实验结果表明，黑暗处理前后，RH基因的表达量均最高，而SWS1的表达量最低;经黑暗处理后，RH、LWS、SWS1和SWS2a基因的表达量显著降低（p0.05）。但RH基因经黑暗处理后表达量仍较高，表明在无光条件下视杆细胞对节律的维持具有重要意义。