利用10Fn3噬菌体库筛选RON包外段结合蛋白

作     者：司艳敏 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘峰涛;马远方

授予年度：2015年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：噬菌体展示技术 RON 10Fn3 噬菌体随机肽库 

摘      要：背景巨噬细胞刺激蛋白(Macrophage stimulating protein,MSP)受体酪氨酸激酶(Recepteur d,origine naetais,RON),是酪氨酸激酶受体亚家族成员之一,通常在上皮细胞、单核巨噬细胞、粒细胞、肺、骨髓等多种正常细胞中均有表达。研究表明,RON的异常表达与多种细胞的恶性转化、肿瘤的侵袭等有很大的关系,因此抑制RON的异常表达对于癌症的治疗具有重要的临床意义。随着细胞生物学的发展,已研究制备出了抗RON的单克隆单体。但由于该单克隆抗体分子质量比较大而难以进入组织发挥作用、来源于免疫小鼠而在人体内易发生免疫排斥反应等缺点,限制了其在临床上的应用。随着噬菌体展示技术的快速发展,利用该技术制备的人源化的以及全人源的抗体即克服了鼠单克隆抗体异源性的缺点,又保留了其均一性、特异性强的优点。虽然噬菌体抗体库的发展为人源抗体的制备提供了新思路,但利用该技术制备的抗体其分子量依然很大、结构相对复杂、需经过一定的修饰(糖基化,加入二硫键等)才能发挥功能。因此,利用与抗体功能类似的小分子蛋白为骨架构建噬菌体随机多肽库,并利用噬菌体展示技术从中筛选出与靶标分子结合的高亲和的小分子多肽已经成为人们制备新型抗体的新方法。自然界中存在多种骨架蛋白,其二级结构具有与重要蛋白相互作用的活性位点,如环状(loop)结构、α-螺旋或β-折叠等,具有这些结构的骨架蛋白暴露在外边的某些碱基组成的结合位点与抗体的互补决定域(Complementarity Determining Region,CDR)具有相似功能,使得这些骨架蛋白具有了构建随机多肽库的可能。其中骨架蛋白第十人纤维素类型III域(The tenth human fibronectin type III domain,10Fn3)就是一种常见的骨架蛋白,其在人总蛋白中约占2%,含量比较高,在细菌噬菌体中也有发现。因为10Fn3结合了多种用于治疗用分子的特征而在1998年第一次被提出作为支架构建噬菌体随机肽库。与其他骨架相比,10Fn3具有免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig)样结构域,并且在N端和C端存在能够与大分子结合的β-折叠样非连续循环结构。此外疏水核心的Ig样域提供了一个稳定的框架结构,使10 fn3具有较高的热稳定性(Tm约为88℃)。重要的是,与可变的Ig相比,作为一种单体、缺乏稳定的半胱氨酸残基转录后修饰、在细菌中快速高效表达的10Fn3,其结构是比较稳定的。在本实验中,我们选取了10Fn3作为支架,并将BC和FG循环结构中的氨基酸随机化,依此构建了限制性的构象型随机肽库,并利用噬菌体展示技术,从中筛选出了与RON结合的高亲和力小分子蛋白的阳性克隆。目的构建以骨架蛋白10Fn3为基础的噬菌体随机肽库,并从该随机多肽库中筛选出与RON胞外段结合的高亲和力蛋白的阳性克隆。方法1.应用RT-PCR技术从乳腺癌细胞MDA-MB-231中钓取RON细胞外段区域的基因。2.分别构建RON细胞外段的克隆载体和表达载体。3.采用瞬时转染的方法,将表达载体转染进293T细胞,收取上清液并纯化出RON细胞外段基因表达的蛋白。4.通过重叠延伸PCR获得以骨架蛋白10Fn3为基础的噬菌体随机多肽库的基因,并将其通过酶切位点SfiⅠ和NotⅠ与表达载体p Cantab5E连接。5.电转化入大肠杆菌XL-Blue,建立初级噬菌体随机肽库。菌液PCR和挑取阳性克隆并送公司进行测序,分别鉴定构建的噬菌体随机多肽库的插入率和多样性。6.分别包被10μg/ml、5μg/m L、2.5μg/m L、1.25μg/m L,0.63μg/m L,0.31μg/m L和50μg/ml、25μg/m L、12.5μg/m L、6.25μg/m L,3.13μg/m L,1.56μg/m L比较抗原包被浓度对筛选富集结果的影响,然后用1×、4×、8×、12×、16×、20×PBST和1×、2×、4×、8×、10×、14×PBST依次洗涤比较筛选环境的苛刻程度对筛选富集结果的影响。7.通过ELISA筛选出与RON胞外段结合的高亲和力蛋白的阳性克隆。结果1.成功构建了RON细胞外段区域的真核表达载体。2.成功表达纯化出抗原RON细胞外段蛋白。3.成功构建了库容量达1.92×107的噬菌体随机肽库,并成功从中筛选出了22个与RON结合蛋白待筛选克隆。4.通过对本实验中筛选条件的比较,确定了洗涤条件对富集度的影响要大于RON包被浓度的影响。结论1.构建了一个库容量为1.92×107的噬菌体随机肽库,建立了一个噬菌体随机多肽库的技术平台,筛选出了RON胞外段结合蛋白的阳性克隆,为以后其功能的检测提供了分子基础。2.在本实验中,通过对筛选过程中RON包被浓度及洗涤条件对富集效率的影响的比较,确