醋酸棉酚对人腺样囊性癌ACC-M细胞生长及E-cadherin、p16基因蛋白表达的影响

作     者：韦雅妮 

作者单位：昆明医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴勇

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：醋酸棉 酚腺样囊性癌 甲基化 抑癌基因 DNA甲基转移酶 

摘      要：目的 1.观察体外应用不同浓度醋酸棉酚(GAA)对人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M生长及凋亡的影响;2.检测不同浓度GAA对人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M E-cadherin、p16 基因的蛋白表达的影响;3.检测不同浓度GAA对人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M甲基转移酶1(DNMT1)的蛋白及mRNA表达影响。初步探讨棉酚的抗肿瘤机制。 方法 1.常规培养人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M、人肺成纤维细胞HFL1,用不同浓度GAA处理,倒置显微镜下观察两种细胞的生长变化及形态学改变;2.通过CCK-8实验检测不同浓度GAA对人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M.人肺成纤维细胞HFL1生长的影响,并计算GAA处理后24,48,72h的ICso值;3.应用流式细胞术(FCM)检测不同浓度GAA处理人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M后24,48,72h的凋亡变化情况;4.应用Western-blot检测不同浓度GAA处理人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M后E-cadherin、p16、甲基转移酶1(DNMT1)基因的蛋白表达变化;5.应用实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测不同浓度GAA处理人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M甲基转移酶1(DNMT1)的mRNA表达情况。 结果 ***-8法检测显示,不同浓度GAA对人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M.人肺成纤维细胞HFL1均有抑制作用,在一定剂量范围内具有浓度和时间依赖性。测得ACC-M的IC5o值：24h IC50=33.20μnol/L,48h IC50=15.50μmol/L,72h IC50=8.60μmol/L。 HFL1的IC5o值：24h IC50=35.13μmol/L,48hIC50=28.00μmol/L,72h IC50=26.80μmol/L;***检测显示,经终浓度为10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L及40μmol/L的GAA处理后,人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M的凋亡率与浓度呈正相关;3. Western-blot检测蛋白表达结果显示,24h：E-cadherin和p16蛋白表达增高,DNMT1降低;48h：E-cadherin和p16蛋白表达增高,DNMT1无明显变化;72h：E-cadherin蛋白表达增高,p16, DNMT1无明显变化;4.实时荧光定量PCR检测显示,经GAA处理后,ACC-M细胞实验组DNMT1的nRNA相对表达量与未加GAA的对照组相比表达降低(P0.05),且随GAA浓度增加呈剂量依赖性降低。 结论 ***能够抑制人腺样囊性癌肺高转移细胞ACC-M生长并诱导细胞凋亡,在一定剂量范围内具有浓度和时间依赖性。 2.一定浓度的GAA能使ACC-M细胞E-cadherin、p16蛋白表达上升,可能是GAA抗肿瘤的作用靶点。 3.一定浓度的GAA能降低ACC-M细胞DNMT1的蛋白表达并使mRNA表达水平下调。提示GAA能使DNMT1活性下调从而发挥抑癌作用,这可能是GAA的抗肿瘤机制之一。