金黄色葡萄球菌生物被膜形成特性及抑制清除方法研究

作     者：梁晏瑞 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐振波

授予年度：2016年

学科分类：08[工学] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：金黄色葡萄球菌 生物被膜 形成特性 抑制清除 

摘      要：金黄色葡萄球菌(简称“金葡菌,***)是一种典型的的食源性致病菌之一,分布广泛且群体生长,可导致多种食品腐败从而给公共卫生及食品安全带来极大威胁。金葡菌容易粘附至食品接触表面,通过自身大量繁殖、分泌代谢产物等方式将其聚集、包围形成生物被膜。生物被膜一旦形成,对外界环境因素抵抗性增强,给食品工业带来严重负担。因此,如何追踪不同基因型金葡菌生物被膜在不同阶段的形成状况,金葡菌生物被膜在食品加工环境中的形成特性及抑制清除效果等,成为急需解决的迫切问题。本文首先以华南地区流行性***为研究对象,运用CV和XTT定量分析方法初步了解生物被膜形成能力范围和差异性分布;其次研究了携带atl、ica、aap、agr等基因的***在不同时间阶段的生物被膜形成情况,分析基因型与生物被膜形成之间的内在联系,同时探讨了外界环境(温度、pH、营养环境、糖、盐等)胁迫条件下的金葡菌生物被膜形成总量和代谢活性情况;最后在金葡菌生物被膜的形成特性基础上,探究了天然产物右旋龙脑(NB),溶菌酶(Lse)单独及联合作用对粘附初期、形成中期、成熟期金葡菌生物被膜的抑制及清除作用,为进一步建立生物被膜防控机制提供理论参考和科学依据。1.以257株华南地区流行性***为研究对象,运用CV法和XTT法分别对其生物被膜形成情况进行定量检测,发现有75.1%(193/257)、22.6%(58/257)、2.3%(6/257)的菌株可形成少量、中等量、大量的生物被膜;有77.0%(198/257)、17.9%(46/257)、5.1%(13/257)的菌株可形成一般活跃、较活跃、非常活跃的生物被膜。通过从菌株、方法不同角度分析,发现需结合菌株基因携带情况进一步研究生物被膜形成特性,同时CV法和XTT法具有互补性,可以结合两者全面评估生物被膜特性。2.从上述***中挑选9株典型菌株为研究对象,探究***在8 h、16 h、24 h、48 h、3 d、7 d和14 d等7个时间阶段的生物被膜形成情况,运用CV法定量检测发现在0-14 d整个阶段,多数生物被膜形成总量不断增加最后趋于不变;运用XTT法定量检测发现,在0-16 h,生物被膜代谢活性逐渐升高,24 h之后均开始逐渐降低,至7 d-14 d趋于稳定不变;CFU平板计数发现生物被膜中活菌数在16 h时处于最高水平约109 cfu/mL左右,随后开始出现数量级减少,至14 d时基本为零。综上可得,金葡菌生物被膜的粘附期约为0-8 h、发展形成期为16 h-48 h、成熟期为3 d-7 d以及脱落分化期为7d-14 d。同时运用CV法探究了携带不同基因位点菌株的生物被膜形成总量,并结合扫描电子显微镜进一步观察发现atl、ica、aap和agr基因分别在生物被膜粘附初期、形成发展中期、成熟期、脱落分化期的过程中发挥重要作用,同时金葡菌生物被膜的形成受多种基因位点和因素共同影响。3.以1株***为研究对象,采用CV法和XTT法定量分析环境胁迫条件下(温度、pH、培养基浓度、葡萄糖浓度、盐浓度)金葡菌生物被膜的形成情况,发现其最适宜温度为37℃,低温、高温会抑制生物被膜的形成;最适宜pH为7,强酸、强碱会抑制生物被膜在粘附期、中期的形成;200%的TSB会促进生物被膜在72 h前的形成,低于100%浓度的TSB会抑制生物被膜在各阶段的形成,且浓度越低作用越明显;低浓度的葡萄糖会促进生物被膜的形成,5%和10%的葡萄糖会抑制生物被膜的形成;10%的NaCl会促进生物被膜的形成,而浓度继续升高至15%、20%的NaCl则会抑制生物被膜的形成。4.以*** 10008、120184和10071为研究对象,在3株菌株上述形成特性基础上,运用CV法、XTT法定量分析NB、Lse单独及联合作用对粘附初期、形成中期、成熟期金葡菌生物被膜的抑制清除作用,对于粘附初期(8 h)生物被膜,不同方法的作用强弱为NB+Lse、NB、NB+Cur、Lse;对于形成中期(24 h)生物被膜,不同方法清除率和抑制率降至40%-70%,其中NB的清除作用最强,NB+Cur对生物被膜的抑制清除作用最弱;对于成熟期(72 h)生物被膜,清除率、抑制率进一步降至20%-50%,NB+Lse、NB对生物被膜的清除作用较强,Lse对生物被膜的杀菌作用较弱;通过光学显微镜、扫描电子显微镜进一步观察控制结果,发现上述实验结果一致。