黑蚂蚁纤溶活性蛋白的分离纯化及其性质研究

作     者：冼永权 

作者单位：广东工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭竹钧

授予年度：2015年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黑蚂蚁 纤溶活性蛋白 分离纯化 纤溶活性 研究 

摘      要：蚂蚁种类繁多,数量庞大,分布广泛,资源丰富,是世界最庞大和最兴旺的昆虫之一,而且历史悠久,据统计已存在地球长达1亿年。其具有生命力强,寿命长、营养丰富等特点。其中蛋白质含量极高,且含有多种人体所必需的氨基酸、微量元素和矿物质。因此,蚂蚁不仅具有较高的食用和营养价值,而且具有极为独特的保健和药用价值,越来越受到人们的青睐。随着社会和经济的不断发展,蚂蚁的食用价值和药用价值也不断的被开发,应用前景十分广阔。本文首次从干黑蚂蚁体内分离纯化得到1种纤溶活性蛋白,并对此蛋白的一些性质进行了初步的研究。采用硫酸铵逐级盐析法对其蛋白质进行提取分离,并利用DEAE-52纤维素离子交换层析和Sephacryl S-100葡聚糖凝胶过滤层析柱对分离所得的黑蚂蚁的蛋白粗提液进行纯化,经SDS凝胶电泳检测,得到相对分子质量约为25kD的多肽单链。经纤溶活性平板法检测,该蛋白硫酸铵盐析最佳饱和度浓度为30%-90%,具有较强纤溶活性,其酶活力为101.1735U/ml,经检测,每克黑蚂蚁纤溶活性相当于67.4552尿激酶国际标准活力单位,Braford法测定蛋白浓度,经计算可知其蛋白浓度为2.8041mg/ml,蒽酮硫酸法测定其含糖量,可测得糖含量为8.1714%,表明了该蛋白可能是一种糖蛋白。本实验研究了不同温度、pH值对黑蚂蚁纤溶活性蛋白酶活性的影响。结果表明,该酶最适反应温度为45℃,说明该蛋白耐热性较差,pH在3.0该蛋白酶活力最高,而pH在4.0-8.0范围内,该酶活力基本保持稳定;此外,本实验还研究了一系列的物化因子对目的蛋白酶活性的影响。实验证明：(1) Na+、K+、Mg2+、Zn2+、Ba2+、Mn2+、Ca2+对该酶均有不同程度的影响,其中,Na+、K+对其酶活性影响较小,Mg2+对该酶纤溶活性有强烈的激活作用,而Zn2+、Ba2+Mn2+、Ca2+等对此酶活力有明显的抑制作用;(2)不同抑制剂、表面活性剂与变性剂对黑蚂蚁纤溶活性蛋白活性的影响不同,其中红霉素几乎对其纤溶活性没影响;肝素钠对其活力的影响较小;青霉素对其酶活性有较弱的促进作用;而PMSF对其酶活性具有较强的抑制作用;而用β-巯基乙醇、吐温-20、DFP、SDS则对该此酶活力有强抑制作用;(3)超声破、紫外线对黑蚂蚁纤溶活性蛋白活性的影响不同,其中,在超声波作用下,随着超声波的频率的增大和处理时间的延长,黑蚂蚁纤溶活性蛋白的酶活力明显的下降。功率相同时,时间越长,酶活性受到抑制越大,活性下降越明显;时间相同时,功率越大,超声波对目的蛋白的作用越强,酶活性抑制效果越明显,下降越明显;在紫外线的照射下,随着时间的不断增长,紫外线对目的蛋白的影响越大,酶活性下降越明显,下降幅度越大。