DNMT1基因shRNA干扰重组体介导的人乳腺癌细胞的增殖抑制作用的研究

作     者：魏钦俊 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹新

授予年度：2008年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：DNA甲基化 DNMT1基因 乳腺癌 RNAi MCF-7 

摘      要：表型遗传修饰(epigenesis)是诱导肿瘤发生、发展一个重要的分子遗传学途径,其中DNA甲基化是最常见的哺乳细胞表型遗传修饰方式。DNA的异常甲基化主要通过DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)来实现。DNMT按照酶功能的不同可分为从头产生DNA甲基化的酶(DNMT3a和DNMT3b)和维持DNA甲基化的酶(DNMT1),其中DNMT1在基因组DNA甲基化维护中有着举足轻重的作用。目前认为正确维持DNA甲基化状态是正常生长发育过程中所必需的,许多肿瘤的发生与甲基化状态的异常密切相关。 本研究拟通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术从mRNA水平来抑制DNMT1基因的表达,使乳腺癌细胞中DNMT1活性下调或抑制,解除乳腺癌发生相关基因启动子区的高度甲基化,从而抑制乳腺癌细胞的异常增殖或逆转乳腺细胞的恶性转变,为探索乳腺癌的临床分子治疗奠定重要的理论和实验基础。 目的:利用RNAi技术,构建靶向DNMT1基因的短发夹状RNA(short hairpinRNA,shRNA)重组质粒,将重组质粒转染到人乳腺癌MCF-7细胞中,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中抑制DNMT1基因的表达作用,以及对乳腺癌细胞增殖和相关基因表达的影响,从而为探索乳腺癌的分子治疗奠定基础。 方法:设计、合成含DNMT1编码基因片段的三个靶点的siRNA,分别与转录载体pGCsi RNAi连接,构建pGCsi-DNMT1重组质粒,测序验证。重组质粒经大量纯化后,用脂质体法转染人乳腺癌细胞株MCF-7。实验分为三组:DMEM组(以等体积DMEM替代转染复合物,作空白对照)、空载体组(转染空载体,作为阴性对照)和实验组(转染三个靶点的重组质粒)。转染后,用荧光定量PCR法检测重组质粒对DNMT1基因mRNA转录水平的影响,同时筛选有效靶点。 用有效靶点转染MCF-7细胞,从细胞和分子水平观察其对人乳腺癌细胞增殖及相关基因表达的影响。光镜下直接观察细胞形态变化;MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;流式细胞术分析细胞周期的变化;荧光定量PCR法检测乳腺癌发生相关基因如RASSF1A、P16、P21、P27及ERβ基因的mRNA表达水平变化。 结果:成功构建了靶向DNMT1基因的三组shRNA重组质粒pGCsi-T1、pGCsi-T2、pGCsi-T3,并经序列分析得到确证。实时荧光定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-T2、pGCsi-T3对乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1基因的转录均有明显的抑制作用,抑制率分别为64.2%和74.7%。 MCF-7细胞转染后,pGCsi-T3重组质粒与空白组和空载体组相比,可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加;荧光定量PCR法检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、P16、P21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而P27基因表达水平未见明显变化。 结论:所构建的pGCsi-T3重组质粒能够有效抑制DNMT1基因在乳腺癌MCF-7细胞中的表达。同时,pGCsi-T3可明显抑制乳腺癌细胞的增殖活性,促进细胞凋亡,其机制可能与DNMT1表达下降后,解除了相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而使得细胞中抑癌基因如RASSF1A、P16、P21以及维持乳腺细胞正常生长分化相关的基因如ERβ的表达上调有关。