苜蓿转化再生体系的建立及LEA3基因研究

作     者：肖荷霞 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱宝成

授予年度：2005年

学科分类：090503[农学-草业科学] 0909[农学-草学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：苜蓿 胚性愈伤组织 lea3基因 转化 再生 

摘      要：苜蓿(Medicago sativa)是重要的豆科牧草之一,具有营养丰富、抗旱、耐盐和防风固沙等特点,在世界上广为种植。但由于干旱和土壤盐渍化限制了苜蓿的推广与应用。通过基因工程技术培育抗旱耐盐新品种是提高盐碱地牧草生产水平最经济有效的措施之一。 胚胎发生晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant proteins, LEA)基因是在种子成熟和发育阶段表达的基因,这些基因也在因受到干旱、低温和盐渍等环境胁迫而脱水的营养组织中高度表达,提高植物的抗旱耐盐性。 本研究选取我国生产上广泛应用的、农艺性状较好的七个苜蓿品种“中苜一号、“皇后、“中国紫花苜蓿、“美国紫花苜蓿、“加拿大苜蓿、“塞特、“德宝,对品种抗盐性和转基因进行了研究。“中苜一号在盐胁迫条件下的成苗率、植株POD酶活、愈伤组织生长率等方面优于其它品种,且在实验室条件下易于诱导愈伤组织和分化。因此,本研究采用“中苜一号来源的胚性愈伤组织建立转化受体系统。 以“中苜一号无菌苗下胚轴、茎、叶三种不同外植体,在附加不同激素的MS培养基上诱导愈伤组织。结果表明:最佳外植体为下胚轴,最佳愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L,愈伤组织诱导频率高达100%。在愈伤组织继代过程中,适当降低2,4-D浓度,同时提高6-BA或KT浓度,或缩短继代时间(由每30d缩短到每15d继代1次),可以明显降低愈伤组织褐化率。愈伤组织经过体细胞胚胎发生途径分化,在MS培养基中单独使用GA 1.0mg/L可获得较高的分化率,为68.7%。将主根饱满,颜色亮白,高约8cm的再生苗移入花园土和蛭石1:1的混合物中,成活率达90%以上。 用以lea3基因为目的基因,bar基因为选择基因的质粒pBY520包裹微弹,基因枪轰击苜蓿胚性愈伤组织。轰击后的愈伤组织在MS+2,4-D 1.0mg/L+6-BA 0.5mg/L的培养基上恢复培养10d后,于8mg/L PPT的选择压力下筛选两个月。对照多死亡或呈病态,轰击后的愈伤组织有小部分呈现正常状态,将其诱导分化出再生植株。从叶片中提取苜蓿基因组DNA进行PCR检测,在21株再生植株中有2株扩增出了目的基因片段。证实lea3基因已导入了苜蓿细胞中,并表达。