β-葡萄糖醛酸苷酶-CaHPO4杂化纳米花的制备及应用

作     者：张腾江 

作者单位：北京理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：戴大章;李春

授予年度：2016年

学科分类：07[理学] 070205[理学-凝聚态物理] 0702[理学-物理学] 

主      题：β-葡萄糖醛酸苷酶 酶-无机杂化 纳米花 生物转化 甘草酸 单葡萄糖醛酸基甘草次酸 

摘      要：单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrtinic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide,GAMG)作为一种天然的甜味剂和重要的中药成分,在食品工业及医药领域具有广阔的应用前景。鉴于化学转化过程中存在杂质多、收率低的问题,课题组前期利用基因工程菌表达产紫青霉β-葡萄糖醛酸苷酶基因来制备工程酶(PGUS-E1)转化生产GAMG,但由于游离酶的稳定性较差和传统固定化方法存在酶活降低等问题,本文利用新型的酶-无机杂化自组装的方法对PGUS-E1进行固定。主要研究结果如下:首先考察了不同二价金属(Co、Mg、Ni、Zn和Ca)对PGUS-E1酶活力的影响,结果显示,添加一定浓度的Ca能使游离酶PUGS-E1的酶活提高24.5%,因此选择Ca作为无机金属离子与PGUS-E1进行杂化制备CaHPO-PGUS-E1杂化纳米花。通过固定化条件的优化,得到了CaHPO-PGUS-E1杂化纳米花的最佳制备条件:Ca(1.6 mM),PB(8 mM),PGUS-E1(0.4 mg mL-1),NaCl(18 mM),pH(6.5),时间(12 h),温度(4°C)。1 mL的反应体系可以生成1.2 mg的纳米花,酶的固定化效率为71.2%,负载量为35.60 mg·g-1,相对酶活为118%。接着对CaHPO-PGUS-E1杂化纳米花的结构和催化性能进行表征,发现纳米花的形状大多呈现圆形花状结构,具有多层分级结构;其平均粒径为3637.4 nm,并且粒度分布均一;通过共聚焦显微镜(CLSM)和红外光谱仪(FTIR)分析证明酶被固定在纳米花结构中;动力学分析表明,固定化酶的kcat/Km值与游离酶相比下降了57%,同时杂化花能显著提高酶的热稳定性。最后,利用CaHPO-PGUS-E1杂化纳米花转化甘草酸生产GMAG,并对其反应条件进行了优化。结果表明,每克纳米花每小时可以水解0.74 mg甘草酸生成GAMG,反应转化率接近100%,而游离酶的转化率仅为83%。而且纳米花连续使用8次以后,酶活仍保持为最初的60%左右,这表明CaHPO-PGUS-E1杂化纳米花具有较好的稳定性。以上研究表明,利用酶-无机杂化自组装的方法对PGUS-E1进行固定能显著提高酶的稳定性和催化活性,具有良好的工业应用前景,为工业生产GAMG提供新技术。