厚朴细胞培养与超低温保存的研究

作     者：陈慧丽 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郑郁善

授予年度：2012年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：厚朴 细胞培养 超低温保存 

摘      要：厚朴(Magnolia officinalis Rehd. et Wils)是木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)木本植物。厚朴全身都是宝，是我国多种用途的经济树种，集饮料、食品、药材、木材和美化环境于一体。厚朴树体高大、树形优美、叶大宽阔、花大洁白、抗病虫、抗污染、生命力极强，是当今街道、公园、住宅小区、花坛、庭院绿化和城市环境美化的理想树种。它与麝香、甘草、杜仲被列为国家指令性管理的4种重要中药材，远销东南亚和日本。厚朴提取物中含有丰富的化学物质，据我国最早的药学专著《神农本草经》记载，厚朴系芳香化湿中药。厚朴药用历史悠久，是木兰属分布较广，而且是较原始的种类，对研究东亚和北美的植物区系及木兰科分类有科学意义。 然而，长期以来受自然灾害和人类对野生药用植物资源的掠夺性开发利用，使得许多药用植物的野生资源濒临枯竭，随着人口的增长和对药用植物资源需求的急剧增加，造成了厚朴野生资源不断减少，现已被列为国家Ⅱ级重点保护野生植物。对濒临枯竭的厚朴种质资源的保存已成为至关重要的问题。 本研究运用植物细胞培养技术，对厚朴愈伤组织培养和细胞悬浮培养技术体系进行了探索，本文通过研究不同因子对厚朴悬浮细胞生长的影响，建立一个快速生长的细胞悬浮培养体系，为用细胞培养技术生产厚朴中有效化学成分提供一些参考。近年来，关于厚朴种质资源保存的研究也不少，为凹叶厚朴的资源再生和种质保存提供了宝贵的技术资料和重要的理论依据，但关于厚朴的悬浮细胞培养超低温保存的研究并不多见。因此，本试验是在前人研究工作的基础上，加以改进和完善，做了厚朴的悬浮培养细胞超低温保存的初步研究，为厚朴种质资源保存措施提供实验基础。主要研究结果如下： 1.愈伤组织诱导和继代培养：在厚朴愈伤组织的诱导试验中，各种培养基很大范围内都可以产生愈伤组织，但试验结果表明，以B＋NAA1.0mg·L＋6-BA1.0mg·L为最适培养基;以B＋2，4-D2.0mg·L＋6-BA1.0mg·L为培养基最有利于愈伤组织分化。最佳外植体是顶芽和茎段;附加浓度为3.00mg·L抗坏血酸最有利于防止愈伤组织褐变;不同激素对厚朴愈伤组织的诱导效果依次是：2，4-D6-BA NAA;愈伤组织培养35d为最佳收获时间。 2.悬浮细胞培养体系的建立：在厚朴细胞悬浮培养中，研究了基本培养基、接种量、激素组合、蔗糖浓度、摇床转速、pH值、通气状况对悬浮培养细胞生长的影响。厚朴悬浮细胞培养体系经过优化，试验结果表明，最适厚朴细胞生长的培养基是B＋NAA1.0mg·L＋6-BA1.0mg·L和B＋2,4-D2.0mg·L＋6-BA1.0mg·L;最佳接种量为0.1g/mL;蔗糖浓度为30g·L时最有利于细胞生长;最佳摇床转速为110rpm;厚朴悬浮培养细胞的液体培养基的pH值在5.6～5.8之间最适合细胞生长;厚朴细胞悬浮培养过程中用棉塞封口效果最好;细胞培养的周期为24d比较好。 3.厚朴悬浮细胞超低温保存的研究：对厚朴悬浮细胞超低温保存中的几个主要因素进行单因子比较试验，研究分析了厚朴悬浮细胞的生理状态以及各种冷冻前处理等因素对超低温保存后细胞生活力的影响。试验结果表明，继代多次后预培养6d、处于旺盛生长期的细胞、采用分步冷冻法，超低温保存后生活力最高;“10%DMSO＋5%Suc作为冰冻保护剂对超低温保存厚朴悬浮细胞起到最佳保护效果，是首选的理想冷冻保护剂;较好的降温程序是将厚朴悬浮细胞装入冷冻管，在0℃冰水中预处理30min，然后放进低温冰箱(一80℃)，以0.5℃／rain的降温速度从0℃降至一30℃，在此温度下停留lh，最后投入液氮(一196℃)中保存。悬浮细胞在液氮中保存10d后，取出用30℃温水解冻效果较好;对超低温保存后细胞的恢复性生长进行验证，发现黑暗环境有利于细胞恢复生长。 综上所述，研究厚朴细胞培养与超低温保存，对推动其药用活性成分和种质资源保存的应用技术研究具有积极意义。