酿酒酵母HOG1基因过量表达载体的构建与转化拟南芥的研究

作     者：岳华 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋卫宁

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：HOG1基因 植物表达载体构建 拟南芥转化 耐盐性鉴定 

摘      要：土壤盐碱化是目前影响农作物产量和质量的主要原因之一。分析植物盐胁迫下的耐性反应,寻找耐盐相关基因并揭示其机制,对揭示植物耐逆的机理具有重要的理论意义,而且对于耐盐作物的培育具有重要的实践意义。酵母是一种真核模式生物,同时也是一种耐盐微生物,研究其基因表达和信号传导系统的调节机制及离子运输机制对于阐明高等真核生物的耐盐机制具有重要的参考价值。HOG1是酵母中参与耐高渗透压重要的调控因子,酵母中对盐胁迫强烈应答的大多数基因都高度或完全依赖HOG1,但HOG1同源基因在高等植物中的表达及其影响还未见报道。本实验利用PCR的方法成功地克隆到了酿酒酵母HOG1基因,并将其成功转入模式植物拟南芥中,同时研究了HOG1基因在拟南芥中的过量表达,本研究结果对运用基因工程手段有效地提高植物的抗逆性提供了一定的基因资源,同时也为培育高效耐盐植物奠定了基础。取得的主要结果如下: ***1基因的克隆和植物表达载体的构建:以酿酒酵母总DNA为模板,根据NCBI网站上已经公布的HOG1基因(登录号:L06279)设计引物,经PCR扩增到完整的HOG1基因,利用引入的BamH I和Sac I酶切位点,将HOG1基因与植物表达载体pBI121经酶切后的长片段相连接,对重组后的载体进行PCR检测和酶切鉴定,成功构建了新的植物表达载体pBI121-HOG1。将重组质粒通过通过电击转化法导入根癌农杆菌GV3101中,Kan抗性筛选平板,并通过菌落PCR检测,证明重组质粒已转入根癌农杆菌GV3101中。 2.拟南芥的转化及分子生物学检测:通过花序浸润法(Floral Dip)转化拟南芥,并且利用标记基因对转基因植株进行筛选,同时进行分子生物学检测。结果表明:经卡那霉素抗性筛选,获得阳性植株22株,转化效率为2.2%。提取T代抗性苗基因组DNA进行PCR检测,共有19株呈阳性,对获得3个纯合的T代植株进行RT-PCR检测,均可扩增到目的条带。 3.转基因植株的耐盐性分析:为了研究HOG1基因的功能及其与耐盐性的关系,在MS固体培养基中添加不同浓度NaCl(0、50、100、150、200 mM)对转基因拟南芥T代进行耐盐性实验。研究结果表明:随着NaCl浓度增加,转基因株系的萌发率显著高于野生型拟南芥,随着胁迫处理的时间的增加,转基因植株生长状况要明显好于阴性对照植株;对转基因植株T代在土壤中的耐盐性分析表明,转基因植株生长速度快于野生型,受盐毒害的程度较轻。初步证明HOG1基因的转入在一定程度上提高了拟南芥的耐盐能力。