仔猪常见致病菌检测芯片的研究

作     者：梁之昶 

作者单位：新疆农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姚刚;陈小玲

授予年度：2008年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：仔猪致病菌 基因芯片 16S rRNA基因 寡核苷酸探针 不对称PCR 

摘      要：目的研究仔猪常见致病菌的基因芯片检测方法。 方法1)选取12种仔猪常见致病菌作为基因芯片检测的靶细菌,从美国国家生物技术信息中心(NCBI)基因库中下载它们的16S rRNA基因序列,利用Biosun2.0、DNAStar、Primer5.0等生物学软件建立数据库,对其进行系统发育分析并在其保守区设计通用引物,在其变异区设计细菌种特异性寡核苷酸探针。2)以11种目标细菌基因组为模板,进行通用引物常规对称PCR,并对扩增的目的片段做克隆测序鉴定。3)做引物不对称PCR,以11种目标细菌PCR产物为靶标,同所设计的备选探针进行芯片杂交,筛选特异性好、信号强的探针。4)优化不对称PCR和芯片杂交条件,包括上下游引物浓度和比例、Taq酶用量、镁离子浓度、退火温度、杂交液成分等要素。5)每条探针分别选取与其相关的阳性菌、阴性菌、空白对照进行基因芯片杂交,确定每条探针的临界值。6)以103pg、102pg、100pg、10-1pg的基因组DNA为模板做不对称PCR扩增,然后与芯片杂交,检验基因芯片体系的灵敏度。 结果1)从49条设计的备选寡核苷酸探针中筛选出7条探针,初步建立了使用2对16S rRNA基因通用引物的支气管败血波氏杆菌(B. bronchiseptica, Bb)、多杀性巴氏杆(P. multocida, Pm)、C型产气夹膜梭菌(Cl. perfringens type C, Cl. perf)、表皮葡萄球菌(S. epidermidis, S. epi)、副猪嗜血杆菌(H. parasuis, Hps)、猪链球菌(S. suis),猪肺炎支原体(M. hyopneumoniae, Mhp)7种细菌基因芯片检测方法,预期同步检测的另外5种细菌中的4种由于16S rRNA基因序列同源性太高(胸膜炎放线杆菌猪与放线杆菌,大肠杆菌与肠道沙门氏菌)未能筛选出合适的探针,空肠弯曲菌因为当时缺乏样品,尚未做杂交试验。2)优化了不对称PCR和芯片杂交条件,确定了上下游非荧光引物与荧光引物的比例为1:30、下游荧光引物终浓度为0.7μM、Taq酶用量为2U/25μL反应、Mg浓度为1.0mM、退火温度为55℃、杂交液以6×杂交液效果较好。3)确定了以阴性菌株和空白对照的背景统计平均值+3SD作为每条探针的临界值。4)敏感性试验显示该芯片对单一致病菌检测的灵敏度为102pg。 结论本研究初步探索建立了检测部分仔猪常见致病菌的16S rRNA基因芯片检测方法。进一步工作重点在继续研究检测其他细菌的探针和用临床样品来验证该基因芯片。