MdAFS细胞质和叶绿体定位表达对植物萜类代谢物的影响

作     者：王茹茹 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张元湖

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：青香蕉苹果 拟南芥 MdAFS基因 萜类代谢 萜类挥发物 

摘      要：萜类代谢化合物对固着生活的植物扮演者重要的作用,它包括初生代谢产物和次生代谢产物。由于萜类代谢种类繁多,功能多样,对萜类代谢的研究显得尤为重要。苹果α-法尼烯合酶(Md AFS)是α-法尼烯代谢途径的终端酶,直接决定α-法尼烯的产生。Md AFS不仅具有α-法尼烯合酶特性,还具有异戊二烯转移酶和单萜合酶特性,它能利用FPP合成α/β-法尼烯,利用GPP合成芳樟醇、β-罗勒烯,β-月桂烯;利用GPP和IPP合成α-法尼烯。本研究通过构建苹果α-法尼烯合酶融合表达载体,将苹果α-法尼烯合酶基因在拟南芥细胞质和叶绿体中过表达,以研究外源导入α-法尼烯合酶对转基因拟南芥萜类代谢的调控及挥发物产物释放的影响。主要结果如下:(1)分别从杭白菊叶片、拟南芥叶片和青香蕉苹果果皮中克隆Rubisco小亚基基因启动子(rbc S1)、叶绿体信号肽(pla)和苹果α-法尼烯合酶基因(Md AFS)构建表达载体p BI122-GFP和p BI122-rbc S1-pla-Md AFS-GFP,瞬时转化本生烟,结果证明pla能够将Md AFS蛋白正确定位于叶绿体中,同时也证明rbc S1启动子能够驱动基因的表达。(2)构建Md AFS细胞质和叶绿体真核表达载体,由农杆菌介导法转化拟南芥,并用PCR和q RT-PCR检测转基因植株,结果证实成功获得了细胞质和叶绿体定位的转基因拟南芥植株。(3)分析ABA(100μM/L)、SA(500μM/L)、ETH(50mg/L)、Me JA(100μM/L)MV(100μM/L)、高温(45℃)、强光(1200μmol/m2/s)和低温(4℃)对Md AFS转录表达水平的诱导,结果表明Md AFS基因的表达受到多种因素的诱导。(4)胞质定位和叶绿体定位转基因拟南芥,在不同生长发育时期叶绿素和类胡萝卜素含量均高于野生型,尤其是盛花期的叶绿素a和类胡箩卜素的含量增加的更为显著。(5)胞质定位转基因株系在莲座期,除At IPI2和At DXS表达上调外,其他被检测的萜类代谢途径的基因均无明显差异,在盛花期时,At AACT2、At IPI1、At HMGR1和At DXS等多个基因相对于野生型均上调表达。莲座期时,叶绿体定位转基因株系的At HMGR1和At DXS表达上调;而盛花期,At IPI1、At IPI2、At HMGR2、At DXR和At DXS表达明显上调。这些结果表明过表达Md AFS影响了拟南芥萜类代谢基因的表达。(6)分别检测转基因和野生型拟南芥叶片和花的挥发物,叶片中的萜类挥发物检测结果表明转基因拟南芥相对于野生型拟南芥产生了D-柠檬烯和香叶基丙酮两种新萜类挥发物;花中的萜类挥发物检测结果表明转基因株系比野生型挥发物明显增加,在f1和P3植株中检测到α-法尼烯((E,E)-α-farnesene),在f6和P4植株中检测到了法尼醇(farnesol),在P2植株中检测到了β-法尼烯((Z,Z)-β-farnesene),在f4,f6和P4均检测到了芳樟醇(linalool)。(7)测定转基因和野生型拟南芥叶片中游离态和结合态的甾醇及花中结合态的甾醇含量,结果表明转基因植物甾醇含量比野生型拟南芥甾醇含量低。(8)与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在氧化胁迫后失绿萎蔫程度较轻,积累的活性氧更少,抗氧化酶维持较高的酶活,膜稳定性更高。表明过表达Md AFS能提高植物的抗氧化胁迫能力。