酵母蛋白酶A抑制剂的研究

作     者：李屹松 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：田亚平

授予年度：2005年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：蛋白酶A 纯化 抑制剂 动力学 Ki 亲和层析 

摘      要：蛋白酶A(PrA)抑制剂在食品、医药、农业等领域有非常广泛的应用前景。本论文利用酵母中分离得到的PrA从灵芝发酵全粉中筛选到一种PrA抑制剂,并对该抑制剂的基本性质作了初步研究。论文不仅改进了PrA的分离纯化方案,而且建立了通过固定化PrA亲和层析筛选PrA抑制剂的高效方法,主要研究结果如下: 1.改进了酵母PrA的分离纯化方案:以疏水层析代替原方案的离子交换层析,得到的PrA比活为12.6μ/mg,纯化倍数为25.2。改进方案后,在酶活和收率差别不大的情况下缩短了纯化周期。 2.灵芝发酵全粉的抽提液经过分级醇沉,Ultrogel AcA44分子筛层析和Source Q强阴离子交换层析,得到一种PrA的抑制剂GLPAI,此抑制剂对PrA的抑制率高达75%。 ***的分子量大约为37000,其中蛋白质和糖的含量相对较高。GLPAI的热稳定性比较好,经过100℃的水浴处理后,对PrA的抑制率仍稳定在70%;GLPAI对PrA的最佳反应pH、最佳反应时间分别为3.5～5.5和1小时。GLPAI对胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶都有一定的抑制作用。 ***的动力学研究结果表明:GLPAI对胃蛋白酶的Ki=4.64(μmol/L),抑制类型为非竞争和反竞争性混合抑制作用;对胰蛋白酶的Ki=33.5(μmol/L),抑制类型为竞争和非竞争性混合抑制作用;对PrA的Ki=2.7(μmol/L),抑制类型为竞争和非竞争性混合抑制作用。 5.固定化PrA反应的最佳条件为:反应pH为4.0,戊二醛终浓度为0.6%,给酶量为40mg/0.2g壳聚糖。在此条件下,固定化酶的回收率为45.9%。 6.以固定化PrA为固定相,灵芝发酵全粉抽提液为流动相,通过一步亲和层析提取到PrA抑制剂。此抑制剂分子量为34000,与GLPAI相近,而且其中蛋白质与糖的含量的比例与GLPAI的相近,因此可以推断通过亲和层析提取到的PrA抑制剂和GLPAI可能是同一物质。