基于新型纳米发光和磁性材料的甲胎蛋白临床检测试剂盒的研发

作     者：胡栩华 

作者单位：东华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周兴平

授予年度：2009年

学科分类：07[理学] 070205[理学-凝聚态物理] 08[工学] 080501[工学-材料物理与化学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 0702[理学-物理学] 

主      题：磁性纳米粒子 锑化镉 免疫测定 甲胎蛋白 

摘      要：肝癌是一种高危险性的恶性肿瘤,被称为当今世界的三大肿瘤杀手之一。因此,开发一种快速而廉价的检测方法,对提前预测肝癌并及时采取治疗措施显得尤为必要。目前,预测是否患有肝癌的常用手段是检测血清中的甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,称α-FP或AFP)量。而检测AFP浓度的常用方法为酶联免疫沉淀分析、免疫印迹、和免疫荧光分析。然而,这些方法不但耗时耗力,而且需要经过训练的专业人员进行操作,还需要先进的仪器设备。 在过去的几十年中,半导体量子点(通常被称为量子点,简写为QDs)CdTe已经引起了广泛的关注,CdTe具有的诸多优点使它比传统的染料具有更明显的优势,更适合于生物医学领域的应用。同时,磁性纳米粒子由于其本身特性在生物医学领域的应用也得到推广。但是,结合这这两种纳米粒子的本身优势的具体应用还很少报道。 首先,本文将阐述CdTe量子点的制备,并对其制备过程进行优化,然后把CdTe量子点和模型蛋白——牛血清白蛋白(BSA)——结合。CdTe的制备采用巯基水相法,即利用L—型半胱胺氨酸(L-Cysteine,简称L-Cys)作为稳定剂,在水相中进行合成。同时对CdTe量子点的制备过程中具有至关重要作用的因素做出系统研究,这些因素包括反应时间、反应前驱体中环境pH值,反应物浓度以及反应物摩尔比等,并通过对这一系列反应条件的改变,获得制备CdTe量子点的最佳条件。同时,将制备出的CdTe量子点与模型蛋白BSA结合,观察结合前后荧光强度的变化,结果显示,CdTe量子点可以作为一种很好的蛋白质探针。 其次,本文将阐述制备出顺磁性良好的FeO-dextran(右旋糖酐)磁性纳米粒子,并对这种磁性纳米粒子的分散性做出表征,观察它的分散性。使用蒽酮比色法检测FeO-dextran磁性纳米粒子所携带的右旋糖酐的量。结果发现,1mg的磁性纳米粒子表面包含的右旋糖酐的量约为390μg,这说明FeO-dextran纳米粒子表面携带足够的右旋糖酐,使用碘酸钾(KIO)将右旋糖酐的羟基氧化为醛基,这样醛基就能够比较容易和蛋白质的氨基相互作用生成共价键,最终实现FeO纳米粒子和蛋白质分子的共价结合。这为下一步将抗体结合在FeO-dextran表面打下基础。 最后,本文将阐述如何制备标准工作曲线、推算标准工作方程以及临床血液样品的分析,其步骤为:(1)将制备好的FeO-dextran纳米粒子氧化,然后和鼠抗人AFP抗体(记为第一抗体)进行结合,得到“FeO—第一抗体复合物。使用这种复合物与一系列已知标准浓度的抗原结合,通过磁分离对抗原进行分离纯化,得到“磁性纳米粒子—第一抗体—抗原复合物。(2)制备水溶性荧光纳米粒子,并将其与另外一种鼠抗人AFP抗体(区别于第一抗体,与第一抗体识别抗原的位点不一样,记为第二抗体)结合,得到“CdTe-第二抗体复合物。(3)将“CdTe-第二抗体复合物和“FeO—第一抗体—抗原复合物作用,得到三明治复合物。结合磁分离,洗去未结合的“CdTe-第二抗体复合物,然后将产物定容至1ml并测荧光,得到荧光强度和抗原浓度的对应关系,绘制出“荧光强度—抗原浓度工作曲线,并根据该工作曲线,算出标准工作方程:Y=k(X+4.5)/V。(4)使用同样的方法处理临10例床血液样品。实验结果发现,当血液样本的血清中AFP含量较高的时候,本实验所得到的检测结果和使用时间分辨荧光检测所得到的结果较为相似,当血液样本的血清中AFP含量较低的时候,本实验所得到的检测结果和使用时间分辨荧光检测所得到的结果偏差较大。出现这种结果可能的原因是受到本体干扰。 由于条件限制,本课题不能随意采集到人体血样,期望在后续的研究中,能够在采血过程中注意血液的前处理,减少处理不当带来的本体干扰。同时,纳米粒子的制备过程有待进一步优化,以制备出半坡宽更窄的CdTe量子点和单分散性更好的FeO-dextran磁性纳米粒子等。 本课题所述的方法同样适用于其它“抗原—抗体体系的应用,只要更换相应的抗体,即可对相应的抗原进行定量分析。