柠条锦鸡儿Ckγ-ECS基因抗旱功能研究

作     者：逯佰艳 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：白娟

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：干旱胁迫 柠条锦鸡儿 气孔发育 生长素 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 

摘      要：干旱是导致我国荒漠化和沙土化的主要原因,尤其在西北地区更为明显。干旱环境引起植物体内氧化还原异常,影响植物正常生长发育。叶片是植物发生同化和蒸腾过程的主要器官,叶片表皮气孔的变化是旱区植物长期适应干旱的重要方式之一。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)是谷胱甘肽合成的限速酶,谷胱甘肽是重要的硫醇化合物,在植物响应干旱胁迫过程中发挥重要作用。谷胱甘肽会影响生长素输出载体的水平,从而调节生长素在根部的分布。研究表明气孔发育也受到生长素的调控,从而影响植物的抗逆能力。柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii Kom.)是分布于我国西北地区典型的豆科灌木,由于其良好的适应性,是我国干旱地区水土保持和防风固沙的主要树种之一。目前对柠条锦鸡儿Ckγ-ECS基因影响抗旱性分析在分子水平研究较少,因此本研究主要开展柠条Ckγ-ECS的功能研究,揭示该基因如何通过生长素影响气孔发育的分子机制,对旱区植物干旱适应性研究具有重要的理论和实践意义。主要的试验结果包括:(1)从安塞,神木和东胜三个降雨量依次降低的地区采样,气孔密度与降水量呈正相关,表明气孔密度降低可能是柠条适应干旱的重要方式。用不同浓度PEG6000处理,柠条主根随PEG6000浓度增加呈增长趋势,根冠比增加,植株高度和叶片面积均呈降低趋势,表明干旱环境下促进柠条根系伸长,而抑制地上部分生长。qRT-PCR分析表明,气孔发育相关基因CkFAMA和CkSTOMAGEN转录水平随干旱程度加重呈下降趋势,生长素相关基因CkAXR3和CkARF5表达量升高。Ckγ-ECS基因表达及酶活性都显著增加,表明Ckγ-ECS能及时响应干旱胁迫。以上结果表明:干旱处理后柠条形态建成更有利于适应干旱环境,并且诱导Ckγ-ECS基因大量表达,生长素相关基因表达上调,气孔发育相关基因表达下调。(2)从柠条中克隆Ckγ-ECS基因的cDNA序列全长为1527bp,编码508个氨基酸,分子量57.59kDa。利用农杆菌介导浸染拟南芥获得过表达Ckγ-ECS植株,通过RT-PCR和Western Blotting鉴定阳性植株。(3)与野生型相比,主根较长,过表达拟南芥幼苗叶面积呈降低趋势,叶片细长;通过扫描电镜观察叶片表皮,发现气孔密度和气孔开度都降低。与野生型相比,过表达拟南芥γ-ECS酶活性显著增强,AtAXR3和AtARF5在过表达拟南芥中表达量提高,表明过表达Ckγ-ECS影响了生长素信号通路中基因表达。AtFAMA和AtSTOMAGEN转录水平表达较低,AtEPF1表达上调,表明过表达Ckγ-ECS对气孔发育产生影响。以上结果表明Ckγ-ECS基因可能通过生长素信号负调控气孔发育。(4)干旱胁迫下,过表达拟南芥植株生长能力更强,叶片含水量较高,失水率及丙二醛含量较低。表明过表达Ckγ-ECS增强了拟南芥保水能力,提高拟南芥抗旱性。综上,我们推测柠条Ckγ-ECS基因可能通过影响生长素途径影响气孔发育,通过负调控降低气孔密度,提高植物抗旱性。