漆酶高产菌株的选育及其酶学性质研究

作     者：王诗然 

作者单位：安徽工程大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵世光

授予年度：2010年

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主      题：漆酶 低能离子束注入 选育 优化 酶学性质 

摘      要：近年来,有关漆酶的研究已引起人们的广泛关注。漆酶(Laccase. EC.1.***.3.2)是一种含铜离子的多酚氧化酶,广泛分布于真菌特别是白腐菌中。漆酶可与多酚类和芳香二胺类等多种底物作用,因此广泛应用于工业生产的各领域中。本文以漆酶产生菌灵芝菌(Ganoderma lucidum)U60为出发菌,采用低能N+束注入技术诱变选育得到漆酶高产菌株UIM-281,并对菌株产酶条件、漆酶的纯化、酶学性质进行了研究。主要研究结果如下： 1、利用低能N+束注入技术对漆酶产生菌灵芝菌(Ganoderma lucidum)U60菌丝体进行辐照诱变。通过研究15 keV能量下不同注入剂量与灵芝菌存活率及突变率的生物学效应关系,确定了在2.6×1015～3.9×1015 ions/cm2注入剂量范围内可获得高比例正突变株。选择3:12×1015 ions/cm2的注入剂量参数后,经多轮注入诱变,获得了遗传性稳定的漆酶高产突株UIM-281;发酵产酶实验表明,UIM-281的产漆酶活力峰值分别是出发菌株U60的1.7倍及2.28倍,且产酶发酵周期相对缩短24 h,是工业发酵中更加经济高效的灵芝漆酶发酵菌株。 2、通过单因素试验和Plackett-Burman设计法,进行灵芝菌UIM-281发酵产漆酶培养基主要因子的筛选,得到玉米粉、麸皮和ABTS的质量浓度三个显著因素。最陡爬坡实验逼近以上三因素最优水平后,应用中心组合设计以及响应面分析,建立了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,得到最优发酵条件为：玉米粉17.56 g/L,麸皮17.91 g/L, ABTS 0.0274 g/L葡萄糖10 g/L,豆粉10 g/L, KH2PO4 4.5g/L,经验证,在此条件下,漆酶酶活为6325.3 U/L,比化学合成培养基漆酶产量提高了将近1.27倍,该研究为工业发酵产漆酶提供了理论依据。 3、首先采用Plackett-Burman(PB)设计法筛选出影响灵芝菌G. lucidumUIM-281发酵产漆酶的主效应因素为装液量、摇床转速和培养时间。最陡爬坡实验逼近以上三因素最优水平后,应用中心组合设计以及响应面分析,建立了以漆酶酶活为响应值的二次回归方程模型,得到最优发酵条件为：装液量52 mL,摇床转速158 r/min,培养时间172 h,温度28℃,接种量10%,初始pH5.5,种龄96h。上述条件下理论预测值8342.6U/L,验证实验测得酶活为8387.7U/L,与预测值接近,说明预测模型可靠性较高,可应用于漆酶发酵条件的优化。 4、对UIM-281所产粗酶液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE),活性染色结果表明该漆酶无同工酶。通过35%-65%丙酮二级沉淀和微孔滤膜过滤进行纯化后,由SDS-PAGE测得漆酶的表观分子量约为46 KDa。漆酶酶学性质研究结果表明：该漆酶的最适反应温度为50℃,最适反应pH为6。在10℃和pH 4.8时保存具有最佳的稳定性;金属离子Mn2+、Ba2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+和抑制剂巯基乙醇、十二烷基硫酸钠和叠氮化钠对酶都有不同程度的抑制作用,其中Fe2+,十二烷基硫酸钠和叠氮化钠表现出强烈的抑制作用,而Co2+和Cu2+对酶有明显的激活作用,Zn2+和Na+则对酶活的影响不大;米氏常数Km为1.552 mmol/L。