芽孢杆菌缓释剂的制备及其缓释效能研究

作     者：陈虹娇 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵思峰

授予年度：2018年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：芽孢杆菌 GFP标记 缓释剂 棉苗立枯病 防治效果 

摘      要：目的:为了提高实验室前期筛选出的,能有效防治棉花土传病害的2株拮抗芽孢杆菌,Bacillus atrophaeus B44和Bacillus subtilis S37的持效期和防病效果,筛选出缓释包衣材料并制备芽孢杆菌缓释剂,通过盆栽实验,测定其对棉苗立枯病的防效及其作用机制。为更合理的使用芽孢杆菌制剂防治棉苗立枯病提供技术支撑。方法:通过Spizizen法将质粒PGF4412分别转化到2株芽孢杆菌Bacillus subtilis S37和Bacillus atrophaeus B44中,进行绿色荧光标记与抗性标记;随后选择单宁酸与三氯化铁、明胶与γ-聚谷氨酸、碳酸钙与多巴胺3种不同缓释材料组合制备缓释剂,通过抗性培养基回收计数法,测定缓释菌剂的贮藏稳定性,通过盆栽实验测定其在棉花土壤根际的持效周期及其对棉苗立枯病的防效;选择3种不同的化学杀菌剂,22%的氟唑菌苯胺(FS)、甲霜·种菌唑(ME)、多菌灵(WP),以及混合菌剂、清水作为对照处理,比较缓释菌剂在不同温度下,对棉种的发芽率、出苗率,以及株高等农艺性状的影响,评价缓释菌剂对棉苗在低温胁迫下的保护作用效果,并测定棉花在5C、15C和25C,3个温度条件下,经过不同胁迫天数后,棉花组织生理指标的变化,评价缓释菌剂对棉苗在低温胁迫下的保护作用机制。结果:1、在使用抗性平板氨苄青霉素终浓度为15μg/mL时,成功将带有GFP的质粒PGF4412转化进芽孢杆菌*** B44进行荧光标记,而成功转化*** S37的氨苄青霉素终浓度为20μg/m L。将带有GFP标记的芽孢杆菌施用到棉花根部后,发现这两株菌仅在棉苗根表定殖。且初始接菌量越高,两株菌在土壤中及棉苗根表的定殖量越高。其中B44在初始接菌量最大时对棉苗立枯病的防效最好,S37在初始接菌量为1×10 CFU/g时,对棉苗立枯病的防效达到51.7%。2、对不同包衣材料进行筛选发现,碳酸钙与多巴胺组合制备聚多巴胺芽孢杆菌缓释剂的包覆率以及其在不同pH的PBS缓冲液中的释放率最好,其包覆率为87.4%,在常温下贮存200 d后,菌体存活率仍高达91.33%。盆栽结果显示,使用2.5 g/200粒棉籽的混合芽孢杆菌菌剂拌种后,其对棉苗立枯病的防效为48.4%,而以相同浓度的聚多巴胺缓释菌剂拌种后,其对棉苗立枯病的防效达到54.6%,差异显著;并且在该浓度条件下,缓释菌剂在土壤中40d后的菌落密度下降为4.33×10 CFU/g,而混合菌剂则为3.04×10CFU/g,存活数量和持效期显著提高。3、3种化学药剂,以及混合芽孢杆菌和缓释菌剂对棉花种子进行包衣处理,均能提高棉花在低温胁迫下的发芽率与出苗率。在15C低温胁迫下,缓释菌剂处理棉种后的保护作用效果更为显著,对棉种的发芽率、出苗率分别提高了19.6%和11.3%,在低温处理第5 d后,使植物组织的蛋白含量增加了28.4%,HO的累积减少49.6%,PAL的产生提高28.3%。在适温25C下,缓释菌剂对棉苗具有显著促进生长的作用,但在更低温度5C下,缓释菌剂对棉苗抗低温胁迫的保护作用效果并不显著。结论:两株菌均只能在棉苗根表及根际土壤定殖,且定殖量与两株菌对棉苗立枯病的防效之间为正相关。筛选得到聚多巴胺与碳酸钙组合的包衣材料,对两株芽孢杆菌的包覆效果最为理想,该材料包覆形成的缓释菌剂常温贮藏200 d的稳定性高达91.33%,并且其在土壤中的菌落密度下降率也低于混合菌剂。缓释菌剂在15C低温胁迫下,其对提高棉种发芽率、出苗率及其他指标均有显著效果,但不及化学药剂甲霜·种菌唑和多菌灵这2种药剂的作用效果明显,与氟唑菌苯胺和混合菌剂相近。