基于工具酶信号放大技术检测单碱基突变和地沟油的研究

作     者：葛玉洁 

作者单位：青岛科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马翠萍

授予年度：2012年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083202[工学-粮食、油脂及植物蛋白工程] 

主      题：信号放大 化学发光 单碱基突变 线粒体DNA 荧光定量PCR 地沟油 

摘      要：在生化分析中有许多待检测的物质由于其本身含量较低，无法用当前常规的方法检测出来，因此发展高灵敏的信号放大技术对不能直接扩增的低浓度待测物质进行检测，在当前生化分析研究中尤为重要。在本论文的研究中，以工具酶的信号放大技术为基础，结合化学发光检测和荧光定量PCR检测技术，分别提出了对单碱基突变和地沟油快速检测的方法。其主要内容如下： 1.利用链置换循环放大化学发光法检测单碱基突变 本章基于链置换循环放大和磁珠分离技术建立了一种操作简便、快速，室温下可以高灵敏度和高特异性的检测单碱基突变的化学发光生物传感器。本章中设计单碱基突变位点为T4DNA连接酶的连接位点，目标DNA若为突变体DNA，T4DNA连接酶则将发夹探针与报告探针连接起来，再通过Klenow Fragment(exo-)聚合酶进行信号的循环放大，最终检测化学发光信号;而当目标DNA为野生型DNA，T4DNA连接酶则不能将两条探针连接起来，也无法进行信号循环放大，因此检测不到化学发光信号。该方法利用T4DNA连接酶和KlenowFragment(exo)聚合酶进行化学发光信号的循环放大，最终实现了对DNA单碱基突变高灵敏度、高特异性的检测，其检测限为1.3×10mol/L(3σ)。 2.基于外源动物特征DNA荧光定量PCR快速检测地沟油的研究 本章中构建了一种基于线粒体特征序列和荧光定量PCR技术实现地沟油快速、灵敏检测的方法。本章转换检测的理念和检测对象，以样品油中外源动物特征DNA作为检测的靶标，设计可以辨别鱼和多种反刍动物线粒体的特征引物。从样品油中提取线粒体DNA后，利用荧光定量PCR方法，对提取的DNA进行信号扩增，通过样品Ct值的比较，可以定性甚至定量的对样品油作出判断。该方法将线粒体DNA的多拷贝数、小分子量、结构稳定和聚合酶链式反应的高灵敏度、高精准度相结合，以样品油中外源动物特征DNA作为检测的靶标，构建了地沟油快速、灵敏、特异的检测方法。