芒果畸形病病原菌鉴定与病原菌的GFP基因标记

作     者：吕延超 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谢艺贤

授予年度：2010年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：芒果畸形病 病原菌 层出镰刀菌 生物学特性 绿色荧光蛋白基因 

摘      要：芒果畸形病(mango malformation disease)是世界性芒果重要病害,根据受害部位不同,芒果畸形病可分为营养器官畸形和花序畸形,畸形花序几乎不能结果,严重时可导致果树发育不良,植株矮小,产量锐减。该病害在国外芒果产区发生日益普遍,危害渐趋严重,但目前尚无有效的防治措施。国外报道,芒果畸形病由镰刀菌侵染引起,不同地区病原镰刀菌种类有所不同。在国内,该病在四川攀枝花和云南华坪芒果园已有发生为害,个别果园为害严重,有蔓延趋势,国内对此病害的病因尚未明确。为明确国内芒果畸形病病原,以便为防治提供理论依据和为今后开展更深入的研究工作奠定基础,本论文对发生在我国四川和云南的芒果畸形病开展了病原学研究,并对其中一个菌株做了绿色荧光蛋白(GFP)基因标记。研究结果如下： 1、首次明确层出镰刀菌为芒果畸形病病原菌。四川攀枝花和云南华坪两地芒果园采集的芒果畸形病标本,通过组织分离、柯赫法则验证,病原菌形态学鉴定、ITS序列及β-tubulin基因序列分析辅助鉴定,确认其病原菌均为层出镰刀菌[Fusarium proliferatum (Matsushima) Nirenberg]。并在国际上首次证实该镰刀菌可以引起芒果畸形病。 2、较为系统地测定了芒果畸形病病原菌的生物学特性。发现该病原菌生长的最适温度为24℃,最适pH为10;分生孢子萌发最适温度为24℃,最适pH值为5。病原菌能够利用供试的各种碳源和氮源生长,其中碳源以果糖最好,氮源以蛋白胨最好;连续光照处理菌丝生长速率高于交替光照或持续黑暗处理;分生孢子的致死温度为55℃,20min或者60℃,5min。 3、在国内外首次用绿色荧光蛋白(GFP)基因标记层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备了病原菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sGFP)转化原生质体,获得表达GFP的转化子;转化子在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后,在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光,用GFP特异性引物PCR扩增转化子基因组DNA获得预期大小片段,表明GFP基因已成功导入芒果畸形病病原菌基因组且稳定遗传;GFP标记菌株生长正常,致病性和野生菌株无明显差别。 本论文明确了发生在四川攀枝花和云南华坪两地的芒果畸形病病原菌,并阐明了该病原菌基本的生物学特性,有助于更好地指导该病害的防控;获得GFP标记的病原菌菌株,为进一步深入研究该病原菌侵染方式、扩展过程、传播途径等奠定了基础。