噬菌体展示技术筛选bFGF结合肽

作     者：颜秋霞 

作者单位：暨南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李校堃;吴晓萍

授予年度：2007年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：噬菌体展示技术(PDT) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 成纤维细胞生长因子受体(FGFR) 结合肽 绒毛尿囊膜(CAM) 

摘      要：目的：利用噬菌体展示技术获得与bFGF特异性靶向结合肽。研究其是否具有bFGF促分裂活性的激动作用或拮抗作用，并通过该短肽探讨FGFR上的bFGF结合位点及bFGF-FGFR相互作用关系，以寻求可拮抗bFGF活性的小分子短肽，探讨小分子短肽作为血管生成抑制剂的可行性，从而为新型的抗肿瘤药物的开发奠定基础。 方法：以bFGF为靶标，对噬菌体随机7肽库进行3轮生物淘选。采用ELISA检测单克隆噬菌体对bFGF的亲和性和特异性，选取阳性克隆进行DNA测序，推导其展示的肽序列。通过对多组候选肽的序列分析和特性预测，找寻具有与FGFR的一致序列或同源序列的先导肽。再通过竞争抑制实验，分析先导肽噬菌体与bFGF的竞争结合活性。采用MTT法检测先导肽噬菌体和人工合成的先导肽对由bFGF诱导的Balb／c3T3细胞增殖的抑制作用，并用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验检测先导肽抑制血管生成的作用。 结果：对7肽库进行3轮的筛选后，阳性率逐步提高并达到30％，阳性噬菌体都能特异性与bFGF结合。从富集的噬菌体中获得12个高亲和、高特异的阳性克隆。测序结果表明，获得11种不同序列的候选7肽，其中2个克隆为一致序列。一致序列呈酸性，与FGFR2 D3的255～261氨基酸残基具有较高的相似性，并有着相似的疏水轮廓。先导肽噬菌体能够特异地与bFGF结合，呈剂量依赖性。先导肽噬菌体与固相bFGF的结合能被游离的bFGF竞争抑制。细胞实验和CAM实验表明先导肽对Balb／c 3T3细胞增殖和血管生成有一定的抑制效应。 结论：从噬菌体随机7肽库中筛选到与bFGF有高亲和力的阳性噬菌体克隆，噬菌体表达的7肽可能模拟FGFR2 D3的bFGF结合序列，与跨膜FGFR2竞争结合bFGF，阻断bFGF-FGFR2通路，从而抑制了bFGF的促Balb／c 3T3细胞增殖和促鸡胚CAM血管生成作用。这为进一步定位FGFR2的bFGF结合区域，设计血管抑制肽，开发抗肿瘤肽类新药提供了有力的基础。