固氮施氏假单胞菌非编码RNA基因crcZ和crcY的转录特性及其RNA稳定性研究

作     者：黄义 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：张维

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：施氏假单胞菌A1501 碳代谢物抑制 非编码RNA 转录 转录后稳定性 

摘      要：碳代谢物抑制(Carbon Catabolite Repression,CCR)是指在多种碳源存在条件下,细菌优先利用优势碳源,同时抑制非优势碳源的利用达到最佳生长的现象。研究表明,RNA结合蛋白(如Crc和Hfq)在转录后水平负调控非优势碳源代谢基因的表达,而其与靶标的结合活性受非编码RNA(ncRNA)的竞争抑制。ncRNA与抑制蛋白之间的数量关系影响了菌体对碳源的选择。优势碳源存在时,RNA结合蛋白与靶标基因mRNA结合,抑制相关蛋白表达,菌体不能利用非优势碳源。当优势碳源消耗殆尽时,ncRNA高水平表达,与抑制蛋白结合,靶标mRNA得以释放,细胞开始利用非优势碳源。参与CCR调控的ncRNA广泛存在于假单胞菌中,但不同种中所含的ncRNA种类不同,固氮施氏假单胞菌A1501含有两个ncRNA CrcZ和CrcY,但其表达规律及功能分化尚不清楚。本论文以施氏假单胞菌A1501为试验材料,探究crcZ和crcY基因在不同营养环境中的表达特性及其转录产物的稳定性,取得的主要结果如下:1.分别构建了ncRNA crcZ和crcY的启动子-lacZ融合表达载体PcrcZ-lacZ和PcrcY-lacZ,用于研究不同营养环境下crcZ和crcY的启动子活性。β-半乳糖苷酶酶活测定结果表明,crcZ在LB培养条件下启动子活性最低,为85 U,以优势碳源乳酸钠和非优势碳源葡萄糖为唯一碳源培养条件下的启动子活性相当,均为LB丰富培养条件下的4.9倍;crcY在以上三种培养条件下启动子活性存在显著差异,LB培养条件下最低,为209 U,乳酸钠和葡萄糖分别为唯一碳源条件下启动子活性依次升高,分别是LB培养条件下的2.03倍和3.56倍;相比氮限制条件,固氮条件下crcZ和crcY的启动子活性均变化不大。碳源匮乏相比碳源丰富条件crcZ和crcY启动子活性均升高;在以上测定的培养条件下,crcZ的启动子活性均低于crcY,数字PCR结果显示,CrcZ的胞内拷贝数为crcY的36.8倍,推测这两个ncRNA的稳定性受不同机制调控。2.荧光定量分析和转录活性测定结果表明:苯甲酸为唯一碳源培养条件下,crc(碳代谢抑制控制蛋白编码基因)突变株中,CrcZ的胞内水平和转录活性分别为野生型的0.016倍和0.3倍,CrcY的胞内水平和转录活性分别为野生型的0.21倍和0.18倍,暗示Crc不仅影响了crcZ和crcY基因转录,而且可能影响CrcZ的稳定性。苯甲酸唯一碳源培养条件下,?crc中cbrB和rpoN的表达量相比于野生型下降1倍,推测Crc蛋白通过影响cbrB和rpoN的表达进而正调控crcZ和crcY的转录。RNA稳定性试验结果表明,野生型中CrcZ和CrcY在利福平处理第50 min仍分别保留90%和60%(与处理0 min相比),?crc中CrcZ和CrcY在第17 min即下降50%,表明Crc蛋白正调控CrcZ和CrcY的稳定性。此外,RNA分子伴侣蛋白编码基因hfq的突变株中CrcZ和CrcY水平逐渐降低,在第50 min分别下降21%和36%,而野生型中CrcZ和CrcY在第5 min即下降约40%。上述结果表明,CrcZ和CrcY的稳定性受到Crc和Hfq蛋白的影响。生物信息学分析结果表明,预测的施氏假单胞菌A1501 CrcZ和CrcY的茎环结构的环上富含发挥调控功能的“CA motif,其附近存在着RNase E的剪切位点(单链AU-rich RNA序列),RNase E可能是CrcZ和CrcY功能调控网络中的一个特异性降解酶。本研究初步探讨了不同生长条件、不同调控节点突变体中非编码基因crcZ和crcY的转录特性及转录产物稳定性,为深入研究碳代谢物抑制与固氮作用的网络调控机制奠定了理论基础。