斜纹夜蛾ABCC亚家族拟Bt毒素受体基因的克隆与功能分析

作     者：谌祖文 

作者单位：华中师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘凯于

授予年度：2016年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：斜纹夜蛾 ABC transporters 苏云金芽孢杆菌 超表达 RNAi 

摘      要：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Bt)为一种革兰氏阳性菌,属于芽孢杆菌属,广泛存在于自然界。在其芽孢形成期产生的杀虫晶体蛋白对多种昆虫目的害虫具有毒杀作用且对动植物和人类没有危害,因此,Bt作为生物杀虫剂被广泛应用于农业害虫防治中。然而随着Bt杀虫剂的广泛使用和转Bt作物的种植导致昆虫抗性的产生,严重限制了其长期使用,其中Bt毒素受体的改变导致与毒素结合能力的改变是产生Bt抗性的重要原因。斜纹夜蛾(Spodoptera litura)作为鳞翅目害虫之一,对Cry1Ca毒素敏感,对Cry1Ac毒素不敏感,除了 SlAPN已报道是Cry1Ca毒素受体,是否有其他的受体蛋白参与目前还不是很清楚,因此,斜纹夜蛾Cry毒素受体基因的克隆和功能分析对于建立有效的管理策略至关重要。本研究中以斜纹夜蛾虫体及其卵巢来源离体细胞系S1-HP为实验材料,对S1-HP细胞转录组数据进行分析,得到了 ABC转运蛋白超家族13个转录本,分别属于ABCA,ABCB,ABCC,ABCD,ABCG亚家族。基于氨基酸序列比对对其做进化树分析表明SlABCC3与已知的Cry1Ac毒素受体棉铃虫和甜菜夜蛾的ABCC3蛋白一致性较高,表达量较高的另外三个转运蛋白SlABCC1,SlABCC1-like,SlABCC4-like分别属于不同的簇。通过RT-PCR等技术克隆了斜纹夜蛾中肠的SlABCC3 ORF。SlABCC3ORF全长4077 bp,编码1359个氨基酸;蛋白分子量和pI分别为151.69 kD,8.24。通过原核表达系统表达胞内片段,制备了兔抗SlABCC3多克隆抗体。构建了昆虫细胞表达载体pie2-EGFP-N1-SlABCC3。定位分析表明SlABCC3分布在细胞膜上。在S1-HP和TnH5细胞中超表达SlABCC3蛋白可显著提高细胞对Cry1Ac毒素的敏感性;但没有提高细胞对Cry1Ca毒素的敏感性,说明SlABCC3可能为Cry1Ac毒素受体,但不是Cry1Ca毒素受体。通过RT-PCR技术等也克隆了斜纹夜蛾中肠的,SlABCC4-likeORF。SlABCC4-like ORF全长4185 bp,编码1395个氨基酸;蛋白分子量和pI分别为154.86 kD,8.32。构建了昆虫细胞表达载体pie2-EGFP-N1-SlABCC4-like。荧光显微镜观察表明SlABCC4-like分布于细胞膜上。在TnH5细胞中超表达SlABCC4-like蛋白后没有提高细胞对Cry1Ac,Cry1Fa,Cry1Ab,Cry2Aa毒素的敏感性;通过RNAi干扰实验表明SlABCC4-like不介导S1-HP细胞对Cry1Ac和Cry1Ca毒素的敏感性,说明 SlABCC4-like 可能不是 Cry1Ac,Cry1Ca,Cry1Fa,Cry1Ab,Cry2Aa 毒素的受体。总之,上述实验表明SlABCC3是Cry1Ac毒素的受体,但是SlABCC4-like不是Cry1Ac毒素的受体。该研究结果为Bt毒素杀虫剂的开发和Bt抗性的治理提供了重要的参考。