神农架金丝猴源肠道益生菌的筛选和鉴定

作     者：呙会会 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：肖运才

授予年度：2014年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：益生菌 肠球菌 筛选 安全性 有效性 

摘      要：川金丝猴(Rhinopithecus roxellanae)是中国特有的珍稀物种,我国I级保护动物,湖北省神农架地区是川金丝猴生活的的最东端。由于消化道疾病是金丝猴常发疾病之一,且消化道疾病是导致幼猴死亡的主要原因,因此,维持金丝猴肠道微生态平衡,减少金丝猴消化道疾病的发生,对金丝猴个体健康和种群复壮具有重要意义。 本研究以神农架金丝猴为研究对象,通过采集野生金丝猴的粪便300份,MRS培养基共分离到92株兼性乳酸菌,92株菌发酵液上清对病原指示菌均有抑菌活性,但各菌株之间抑菌差异性较大。其中抑菌效果最明显的是dlt6a、dlt6b、dlt6c、dlt7a、 dlt7b、dlt9、dltl0a和dlt10b共8株菌。对该8株菌进行属、种的鉴定,鉴定结果表明分离的8株菌均为粪肠球菌。16S rRNA基因序列扩增测序,肠球菌种特异性片段ddlE、faecalis、ddlE、faecium扩增检测,进一步确证8株分离细菌为粪肠球菌。 对分离的粪肠球菌进行安全性评价,包括抗生素耐药性检测和毒力因子检测,减少菌株存在的潜在危险性。毒力因子的检测方式为PCR扩增cylA、esp、gelE、agg、 efaAfs、ace、efaAfm等基因片段,PCR扩增检测结果为：dlt6a为agg+esp+efaAfs+;dlt6b有agg+esp+efaAfs+;dlt6c为agg+esp+efaAfs+;dlt7a为esp+efaAfs+;dlt7b为esp+efaAfs+;dlt9为agg+cylA+esp+efaAfs+;dlt10a为agg+cylA+efaAfs+;dlt10b为agg+esp+efaAfs+。综合抑菌试验和毒力因子分析,选择***7b和dlt10a为后续试验菌株。抗生素抗性检测结果证明：dlt7a、dlt7b、和dlt10a对氨苄西林、红霉素、万古霉素、环丙沙星、呋喃妥因、壮观霉素、诺氟沙星、强力霉素、氯霉素和庆大霉素敏感;而对青霉素、四环素表现耐药,与肠球菌固有耐药的类型相符。动物急性毒性试验从体态特征观察、细菌易位、脏器指数和脏器组织形态学方面考察分离菌株对动物机体的安全性,结果表明粪肠球菌dlt7a和dlt7b是安全的菌株,dlt10a存在潜在危险性。 为筛选能够成为机体肠道优势菌群的菌株,本试验从菌株生长速度、耐受能力(肠道胆盐高渗透压、胃酸低pH值等)以及耐高温能力等方面评价分离的菌株。结果表明,两株粪肠球菌(dlt7a和dlt7b)具有以下特点：(1)能耐受pH2.5的酸性环境保持活菌数基本不变;(2)能耐受0.5%胆盐浓度;(3)繁殖能力强,无迟缓期,1‰接种量4h后进入对数生长期,9h后进入稳定期;(4)可耐受一定的高温。实验结果表明,两株粪肠球菌能顺利通过胃肠道。 本实验从安全性、抗逆性、生长特性及对动物的安全性等方面进行筛选和鉴定,筛选出两株抑菌效果较好,对机体毒性较小,并且能顺利通过胃肠道的益生肠球菌,为后期生产应用提供了坚实的物质基础。