DcR3 siRNA活化Caspase依赖的线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡的研究

作     者：曹超 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄秋林

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：诱捕受体 肝癌 凋亡 线粒体跨膜电位 

摘      要：目的 探讨诱捕受体（decoy receptor3，DcR3）RNA干扰对HepG2细胞体外抑制作用及诱导其凋亡机制。 方法 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测DcR3在肝癌细胞中的表达情况;MTT法检测DcR3siRNA对肝癌HepG2细胞增殖的影响;光学显微镜检测DcR3siRNA对肝癌HepG2细胞形态学改变;罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）双染，流式细胞术分析测定细胞线粒体膜电位和凋亡率;Caspase-9分光光度法检测试剂盒检测经DcR3siRNA处理后人肝癌HepG2细胞中Caspase-9活性;Western blot检测DcR3siRNA处理后肝癌HepG2细胞中线粒体凋亡信号传导通路相关蛋白细胞色素C（Cyt c）、Caspase-9、Caspase-3、Bax、Bcl-2等表达。 结果 DcR3mRNA在人肝癌HepG2细胞中表达水平是正常肝L-02细胞的3.76倍。MTT显示，DcR3siRNA对人肝癌HepG2细胞生长有显著抑制作用，呈时间和剂量依赖性。转染40μmol·L-1DcR3siRNA12h、24h、48h后OD值分别为（0.26±0.03）、（0.33±0.03）、（0.35±0.02），分别与对照组比较，差异均有统计学意义（p0.05）;转染DcR3siRNA（20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1）及对照NC24h后其OD值分别为（0.21±0.03）、（0.34±0.03）、（0.38±0.04），分别与对照组比较，差异均有统计学意义（p0.05）。形态学观察发现，DcR3siRNA处理24h后，部分HepG2细胞变圆，体积明显缩小，胞质强嗜酸性，核固缩、深染，核染色质积聚至核膜周边，呈现典型凋亡细胞形态。Rh123/PI双染FCM检测结果显示，40μmol·L-1DcR3siRNA处理人肝癌HepG2细胞12h、24h、48h后，HepG2细胞中Rh123荧光强度逐渐降低，凋亡率逐渐增加，呈现时间依赖性关系，与对照组相比，差异均有统计学意义（p0.05）;40μmol·L-1DcR3siRNA合用Ac-LEHD-CHO组（Caspase-9特异性抑制剂香荚兰醛）处理24h后Rh123荧光强度及凋亡率与单用DcR3siRNA处理组比较，差异有统计学意义（p0.05）。Caspase-9分光光度法检测发现DcR3siRNA能以时间依赖方式增加Caspase-9活性，40μmol·L-1DcR3siRNA处理人肝癌HepG2细胞12h、24h、48h后，Caspase-9活性分别为对照组的（5.4±0.4）、（7.8±0.5）和（8.9±0.7）倍，且Ac-LEHD-CHO能拮抗DcR3siRNA对Caspase-9活性作用。Western blot检测结果显示，40μmol·L-1DcR3siRNA能促进Cyt c释放，Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达下调，Ac-LEHD-CHO可以拮抗上述作用。 结论 DcR3siRNA能抑制人肝癌HepG2细胞增殖，并通过活化Caspase依赖的线粒体信号传导途径诱导其凋亡。