Rho激酶抑制剂Y-27632对小鼠早期胚胎发育的影响

作     者：赵虎 

作者单位：河北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李相运

授予年度：2010年

学科分类：08[工学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：Rho激酶抑制剂Y-27632 小鼠早期胚胎 发育能力 细胞凋亡 基因表达 

摘      要：在哺乳动物胚胎的发育过程中大约有30%-70%的胚胎夭折,绝大部分在胚胎发育的早期。体外胚胎发育过程中有着大量发育异常的细胞。细胞凋亡是体细胞清除发育异常细胞的重要途径。研究发现,早期胚胎异常细胞的清除也是靠细胞凋亡途径进行的。在附植前胚胎中凋亡现象的存在较为普遍,即使正常形态的胚胎也存在着凋亡现象,而细胞凋亡是多基因严格控制的过程,其发生是凋亡基因表达的直接结果。为了提高胚胎体外培养存活的能力,探索通过改变培养条件,添加凋亡抑制剂来抑制胚胎细胞的凋亡。 研究发现,胚胎凋亡可以观察到一些形态上的凋亡变化。凋亡细胞形态的改变是由细胞骨架的变化所引起的,而细胞骨架的变化涉及Rho激酶(Rho associated kinase, ROCK)的作用。其中Y-27632被广泛地用作为Rho激酶的特定抑制剂。近年来发现Rho/Rho激酶信号转导通路在胚胎发育过程中起着重要的作用。Y-27632影响胚胎发育能力的研究已有相关的报道,但这些研究大多停留于各时期胚胎发育率的数据统计,而对Y-27632对胚胎作用的分子机制没有做进一步的深入研究。对早期胚胎发育过程中凋亡基因表达变化的研究对于揭示早期胚胎发育机制有重要的意义。 本实验采用形态学观察、TUNEL检测、实时荧光定量PCR的方法,检测Rho激酶特异性抑制剂Y-27632在体外培养条件下对小鼠早期胚胎细胞凋亡及凋亡基因Bcl-2家族(Bax、Bcl-2)表达的影响,初步揭示了Y-27632可能通过调节Bcl-2家族基因的表达,改变小鼠胚胎的质量。 通过形态观察,发现10μM浓度的Y-27632最适宜小鼠早期胚胎的发育。实验组同对照组相比,在2-细胞胚胎培养1d和2d后,桑椹胚、囊胚发育率差异不显著(P0.05)。在培养2d和3d后,分别对胚胎进行细胞计数,发现:2d时,实验组显著高于对照组(P0.05)。并且分别对实验组对照组胚胎进行受体移植,发育出生率差异不显著(P0.05)。结果说明,Y-27632在早期对胚胎细胞数目的增加有一定影响。 经TUNEL凋亡试剂盒染色观察,培养2d时,实验组对照组均不表现凋亡迹象;培养3d时,实验组凋亡迹象显著高于对照组。结果说明,用Y-27632短期培养胚胎不引起凋亡,长期培养引起胚胎的凋亡。 用实时荧光定量PCR研究发现,Y-27632对小鼠早期胚胎发育过程中Bax和Bcl-2表达有明显的影响。10μM的Y-27632在2-细胞胚胎培养3d后,表现出Bax表达增强,Bcl-2表达减弱,说明Y-27632长期培养胚胎促进了细胞的凋亡。