超小超顺磁氧化铁标记大鼠脂肪源间充质干细胞生物学特性的初步实验研究

作     者：姚晨 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张世忠

授予年度：2012年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：大鼠 脂肪源间充质干细胞 超小超顺磁氧化铁(USPIO) 多聚赖氨酸(PLL) 细胞培养 

摘      要：研究背景 帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病,特征性的病理改变是多巴胺神经元凋亡和黑质纹状体通路损害,主要临床表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势平衡障碍。随着人口老龄化的加速,其发病率呈逐年上升的趋势,是威胁老年人健康的一类重大疾病,65岁以上人群发病率超过1%,给家庭和社会都造成了沉重的负担。美国目前约有50万PD患者,且每年以5万例的速度递增,而我国现已逐步进入老龄化社会,PD患者已达到200万人,每年新增帕金森病患者近20万人。若不及时进行有效的治疗,患者病情呈慢性进行性加重,晚期往往全身僵硬、活动受限,约30%中晚期患者生活不能自理,最后常死于各种并发症。目前无论是药物治疗还是手术治疗只能暂时改善症状而不能阻止病情进行性发展。随着再生与组织工程医学的兴起,利用干细胞移植替代凋亡的多巴胺能神经元成为治疗PD一种新策略。 干细胞移植作为治疗中枢系统疾病的新治疗策略而被广泛研究。脂肪源间充质干细胞(adipose-derived stromal cells,ADSCs)是一种极具潜力的种子细胞,自Zuk于2001年发现以来,其生物学特性及分化潜能等方面与骨髓源间充质干细胞非常相似,并且由于ADSCs具有来源丰富、易获取、创伤小、增殖快等优势,使其成为一种更为理想的种子细胞。如何对移植的干细胞标记及活体示踪是近年的研究热点和难点,近年来,得益于分子影像学的快速发展为此提供了可能。磁共振成像(MRI)是目前临床普遍应用成熟的影像学技术,但是常规MR成像的空间、时间分辨率无法显示移植细胞,研究表明,借助新型磁共振造影增强剂可以反复无创地追踪移植的干细胞。其中超小超顺磁氧化铁(ultrasmallsuperparamagnetic particles of iron oxide,USPIO)标记是一种较为理想的MR示踪方法。目前已有不少学者相继报道利用超顺磁氧化铁颗粒(super-paramagnetic iron oxide,SPIO)可成功标记细胞并对其进行示踪,但关于ADSCs的标记及USPIO示踪还鲜有报道,如何提高标记效率同时又减少标记物对细胞的毒性是移植治疗过程中的前提。本课题旨在探讨USPIO对ADSCs的标记的适宜浓度及示踪。 本研究拟采用超小超顺磁氧化铁(USPIO)对大鼠脂肪源间充质干细胞(ADSCs)(?)进行标记,对比分析不同浓度的超小超顺磁氧化铁(USPIO)对ADSCs标记的效率,并分别用CCK-8及Alamar blue方法对已标记细胞的活力进行检测,探寻USPIO对ADSCs适宜的标记浓度。为观测已标记ADSCs在PD模型大鼠体内的存活、迁移提供了相关的实验基础。 目的：建立大鼠脂肪源间充质干细胞的分离和培养方法,并对其形态学、细胞表面标志物进行检测,为USPIO标记ADSCs提供细胞来源。 方法： 1.大鼠脂肪源间充质干细胞的原代培养、纯化、传代 大鼠脂肪源间充质干细胞的原代培养：SD大鼠,体重120+20g,采用36g/L水合氯醛,按1ml/100g体重的剂量进行腹腔注射麻醉,麻醉满意后将大鼠摆俯卧位,固定四肢于平板上,剃除背部及腹部的鼠毛。置于超净工作台上,依次用碘酊、酒精消毒,将解剖器械盒、三个玻璃培养皿(加入冷PBS液)等依次排放在超净台上。严格无菌条件下操作,逐层分离组织,尽量减少出血及红细胞污染,取出肾周脂肪组织,选取含血管较少的部分置于培养皿中,包裹好迅速转移至细胞房。用无菌的0.01mmol/L磷酸缓冲液(PBS)反复冲洗脂肪组织,尽量剔除软组织和血管,然后置于青霉素瓶中用眼科剪剪碎;再用吸管将细碎的脂肪组织转移至一次性离心管(15m1),加入0.075%的Ⅰ型胶原酶37℃振荡消化30min～40min;含10%FBS的DMEM/F12等体积中和,100gm nylonmesh过滤后离心(1200g×10min),弃上清,以含10%FBS的DMEM/F12重悬细胞,轻柔吹打制成单细胞悬液,混匀,细胞计数仪下计数后以1×106/ml密度接种于25cm2塑料培养瓶;置于37℃、5%CO2饱和温度培养箱中培养。48h后全量换液,去除悬浮细胞。以后每2-3天半量换液一次,待细胞生长至70%-80%融合后传代培养。 2.脂肪源间充质干细胞表面标志物的流式细胞仪检测 取第3代ADSCs,将培养好的脂肪源间充质干细胞吹打分离下来,收集于50m1离心管中,并以吸管轻轻吹打、将脂肪源间充质干细胞吹散,250xg4℃离心5分钟,弃上清;用0.01mol/L的PBS10m1重悬细胞,清洗1-2次;用适量0.01mol/L PBS调整细胞浓度1×106个/ml,分装于EP管中,共5管,每管1ml,分别做好标记。分别加入抗鼠CD29-PE、抗鼠CD90-F