肯尼亚Nakuru地区马铃薯软腐病原菌分离鉴定及噬菌体防治研究

作     者：Peter Muturi 

作者单位：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所) 

学位级别：硕士

导师姓名：危宏平

授予年度：2018年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：马铃薯软腐病 16S rDNA BIOLOG 果胶杆菌 荧光假单胞菌 噬菌体 

摘      要：溶果胶细菌能够引起马铃薯黑胫病和其他重要植物软腐病,严重影响食品的质量和产量,阻碍经济发展。本研究的目的主要是分离鉴定肯尼亚Nakuru地区感染马铃薯的溶果胶细菌,并针对分离的溶果胶细菌来分离裂解性噬菌体,从而探究合适的噬菌体混合制剂防治马铃薯软腐病。首先,从Nakuru的Molo和Mau Narok地区的不同农场收集有软腐病病症的马铃薯块茎,用结晶紫果胶酸盐培养基培养并分离病原菌,共获得71株病原菌。致病性测试结果显示其中的36株病原菌能浸染马铃薯块茎。用PCR扩增这36株致病菌的16S rDNA,通过测序对致病菌进行初步鉴定,再用BIOLOG微生物鉴定仪进行精准鉴定。鉴定结果显示36株致病菌中有20株软腐果胶杆菌亚种carotovorum,7株荧光假单胞菌B和9株荧光假单胞菌A,用特异性引物Y1和Y2扩增出了20株软腐果胶杆菌的果胶裂解酶编码基因,进一步证明了这20株致病菌为软腐果胶杆菌。以这20株软腐果胶杆菌作为目标菌株,从湖北省武汉市周边采集的土壤和污水中分离到11株噬菌体,其中有7株来属于肌尾噬菌体科,4株属于长尾噬菌体科。通过监测噬菌体和细菌悬液OD600的变化和一步生长曲线,测试了噬菌体的杀菌活性,并在马铃薯片和块上细菌感染后测试了噬菌体的杀菌活性。结果表明11株噬菌体对软腐果胶杆菌有1到1.5小时不等的潜伏期,能将马铃薯软腐病的发病率降低50%以上,显示出噬菌体可能的生物防治能力。当单独噬菌体或者噬菌体混合剂的滴度达到1×10时,能杀灭90%以上的细菌。实验结果表明噬菌体制剂能裂解所有20株软腐果胶杆菌亚种carotovorum,但对分离的荧光假单胞菌没有杀菌活性;针对两株筛选的耐噬菌体的果胶杆菌,分离出噬菌体pcp5f,其不仅能有效裂解两株耐噬菌体的果胶杆菌,还对黑胫病细菌具有杀菌活性。综上所述,本研究反映了肯尼亚Nakuru地区马铃薯软腐病的病原菌的流行病学,引起的软腐病的溶果胶细菌来自于果胶杆菌属和假单胞菌属,并且开发了一种生态友好型生物防治剂-噬菌体混合制剂,能有效防治马铃薯软腐病和黑胫病。