玉米促分裂原活化蛋白激酶ZmMPK5基因的分离及功能分析

作     者：张丹 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李德全

授予年度：2013年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：玉米 ZmMPK5 基因分离 功能分析 逆境胁迫 

摘      要：植物在生长发育过程中经常遭受各种生物和非生物胁迫，为了抵御不良逆境的影响，植物可以快速感知外界环境变化，并且形成多种防御机制。大量研究表明，MAPK级联途径是真核生物中高度保守的信号通路，在细胞信号的转换和放大过程中起重要作用。MAPK级联途径由MAPKKK、MAPKK和MAPK组成，彼此逐级磷酸化进而传递细胞信号。这些激酶可以将信息从感应器传递到效应器，并在胞内外信号传递中起重要作用。同时，MAPK级联途径通过相互“交谈形成复杂的信号传递网络，从而有效地传递各种特异信号。近年来，从植物中分离到大量MAPKs，其研究主要集中在双子叶模式植物，如拟南芥、烟草和紫花苜蓿等，尤其拟南芥AtMPK3、AtMPK4和AtMPK6是研究最多的MAPKs，但是关于玉米MAPK方面的研究相对较少。本研究以玉米品种Zhengdan958为试材，分离并鉴定ZmMPK5基因，对其序列特征、表达模式，以及过表达转基因植株的抗逆生理功能做了初步研究。主要结果如下： (1)从玉米叶片中分离到ZmMPK5基因，该基因开放阅读框编码一个含有399个氨基酸的蛋白，预测的分子量为44.89kDa。蛋白序列分析证实该蛋白具有进化上保守的11个蛋白激酶催化结构域，在结构域中含有一个TEY基序和一个ATP结合位点，在C-末端还包含一个CD区。进化树分析表明，ZmMPK5属于A族的MAPK。 (2)ZmMPK5-GFP融合蛋白瞬时转化洋葱表皮细胞实验证实，ZmMPK5定位于细胞质和细胞核。 (3)ZmMPK5表达特性分析表明，该基因在玉米幼苗的根、茎、叶中均有表达，在茎中表达量最高，叶次之，根中最低。NaCl和PEG处理均能不同程度的诱导ZmMPK5表达上调，而且外施ABA、HO、MV、MeJA、ETH、SA等也能诱导ZmMPK5的表达，表明ZmMPK5可能参与调控多种胁迫。 (4)ROS抑制剂和淬灭剂预处理，均不同程度的抑制了NaCl或ABA对ZmMPK5的诱导，表明HO可能介导了这一过程。 (5)构建pBI121-ZmMPK5正义表达载体，成功转化拟南芥和烟草。通过PCR及qRT-PCR对带卡那抗性的转基因拟南芥和烟草植株进一步检测，结果证实成功地获得了转ZmMPK5的拟南芥和烟草植株。 (6)在盐胁迫及氧化胁迫条件下，过表达ZmMPK5的转基因烟草种子比野生型(WT)烟草种子萌发率高，幼苗的生长情况比WT烟草幼苗更好。 (7)盐胁迫下，与WT相比，过表达ZmMPK5的转基因烟草积累更多的游离脯氨酸和可溶性糖，以及较低的相对电导率和MDA含量。此外，转基因烟草细胞内ROS积累量少，SOD、APX、CAT和POD的活性较高，并且qRT-PCR结果发现，ROS相关基因和胁迫响应基因的表达均高于WT。 (8)氧化胁迫下，过表达ZmMPK5的转基因烟草积累较少的O2，SOD的活性高于WT。而且MV处理下，转基因烟草的叶绿素含量高于WT，存在较多的绿色子叶。 (9)与WT相比，过表达ZmMPK5的转基因烟草对PVX病原菌的抵抗增强，转基因株系中抗病相关基因PR1a，PR4，PR5和EREBP的表达量均高于WT。 (10)ABA处理下，过表达ZmMPK5的转基因拟南芥种子比WT种子萌发率低，转基因拟南芥幼苗的生长比WT幼苗弱，诱导气孔关闭更强，并且诱导ABA相关基因的表达。