脂肪酶基因工程菌高密度培养及诱导产酶研究

作     者：何晓云 

作者单位：南京林业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王飞

授予年度：2011年

学科分类：081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 

主      题：脂肪酶 毕赤酵母 基因工程菌 高密度培养 诱导产酶 

摘      要：本论文优化了米根霉脂肪酶基因工程菌在摇瓶中的产酶条件,并将其在10L发酵罐中扩大培养,探讨了该菌的高密度培养及诱导产酶条件,包括对脂肪酶基因工程菌的接种量和甲醇补料策略的研究,解决了产酶过程中蛋白降解的问题,并对已克隆的米根霉脂肪酶基因进行了定点突变研究。主要结果如下： 1、在摇瓶培养中,脂肪酶基因工程菌在培养基初始pH6.0、甲醇添加量1%、诱导时间96 h、诱导温度为30℃产酶最佳。采用2%的玉米浆粉取代传统的酵母浸提物和蛋白胨作为氮源,结果显示最高酶活为295 U/mL,不但以廉价的玉米浆替代了昂贵的酵母浸物作为培养基,且酶活提高了20%。 2、脂肪酶基因工程菌在10L发酵罐中的高密度培养研究表明：7.5%接种量,利于脂肪酶基因工程菌的生长和表达;以恒溶氧反馈调控和梯度流加相结合方式补加甘油,补加6h可达预期菌体密度,将菌体培养时间缩短了24 h;在线控制甲醇补料策略利于脂肪酶的表达,酶活提高为692 U/mL,蛋白浓度为1.6g/L,约为恒溶氧反馈调控补加甲醇方式酶活和蛋白浓度的2倍。 3、探讨了在细胞高密度培养中减少脂肪酶降解的策略,包括对pH、添加不同的氮源及含量和诱导温度的研究。结果显示：在pH5.0、补加0.5%酪蛋白、诱导温度为22℃的条件下,经SDS-PAGE检测,重组脂肪酶的降解情况得到了明显改善。 4、进行了10L发酵罐高密度培养条件优化研究,得到的优化条件为：7.5%接种量,生长温度为30℃,pH5.0,采用恒溶氧反馈调控和梯度流加方式补加甘油,诱导温度为22℃,添加0.5%酪蛋白水解物,甲醇的浓度为0.3%-0.5%。在此条件下,最终OD600为479,细胞湿重为419.0g/L,细胞干重为128.3g/L,蛋白浓度最终为3.0g/L,最高酶活为1302 U/mL,比摇瓶表达最高酶活提高约3.4倍。 5、对米根霉脂肪酶基因进行了定点突变(SDM)研究,并将重组质粒转至毕赤酵母KM71H中表达,结果表明：在摇瓶中,脂肪酶酶活为244 U/mL,蛋白浓度为0.38 g/L;在发酵罐高密度培养条件下,脂肪酶酶活为503 U/mL,蛋白浓度为0.91g/L。