番木瓜畸形花叶病毒弱毒突变体的筛选及其交叉保护作用

作     者：谭东 

作者单位：海南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：周鹏;江雪飞

授予年度：2018年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：番木瓜畸形花叶病毒 定点突变 侵染性克隆 弱毒突变体 交叉保护 

摘      要：番木瓜是海南最重要的热带经济果树之一,而番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)一直是影响番木瓜产业发展的主要限制因素。自本研究组于2012年在转基因抗RPSV番木瓜植株上新发现了番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV),PLDMV危害呈逐年上升趋势,逐渐上升为威胁海南番木瓜种植的毁灭性病害,已成为我国番木瓜生产上亟待解决的问题。目前,PLDMV在栽培技术上还很难通过化学防治的方法予以防控。虽然台湾中兴大学已研发出抗PLDMV和PRSV的双抗转基因木瓜,但存在转基因植物的生态风险和食品安全性等方面问题,使转基因番木瓜的推广应用受到极大限制。为了探寻一种对环境友好、高效便捷、应用前景广的绿色防控PLDMV方法。本研究采取交叉保护策略开展PLDMV的防控研究,交叉保护作为植物病毒病害的有效防治手段,已成功应用于柑橘衰退病、西葫芦花叶病和番木瓜环斑病等的防治。而弱毒株的获取是交叉保护应用的关键,为了快速获得用于PLDMV防治的弱毒株,本研究利用人工定点突变策略快速构建并筛选出具有交叉保护作用的PLDMV弱毒突变体,并初步完成了交叉保护评估实验。主要研究结果如下:1.根据69个马铃薯Y病毒属病毒(强、弱毒株)氨基酸序列比对分析结果,并参考其他马铃薯Y病毒属病毒弱毒株或与致病相关决定位点,筛选确定出11个分布于PLDMV-DF的P1和HC-Pro基因上用于弱毒突变体构建的氨基酸位点:Q→S、A-Q、K→E、N→A、R→I、D→K、F→L、IG→DE、T→和E→N。2.利用定点突变技术和本研究组已建立的快速构建适用农杆菌侵染的植物病毒侵染性克隆的方法,人工定点突变快速成功构建了5种分别含有1个突变位点(R)、2个突变位点(R和T)、4个突变位点(N、D、I和G)、7个突变位点(Q、A、K、R、F、T和E)和11个突变位点(Q、A、K、N、R、D、F、T、I、G和E)的p35S-PLDMV-GFP全长cDNA克隆弱毒突变体:p35S-PLDMV-GFP-A、p35S-PLDMV-GFP-B、p35S-PLDMV-GFP-C、p35S-PLDMV-GFP-D和p35S-PLDMV-GFP-E。3.上述5种弱毒突变体克隆经农杆菌注射接种番木瓜植株,病症观察、RT-PCR、ELISA及荧光检测结果显示:接种60天后,5种弱毒突变体均能系统性侵染番木瓜,且侵染效率达80%以上;5种弱毒突变体感染的番木瓜叶片上均未见明显病症,但茎杆局部可见轻微水渍状,叶片和水渍状部分均可见不同强度的绿色荧光;5种弱毒突变体在番木瓜中的病毒积累量均显著低于野生型强毒株,但5个弱毒突变体克隆之间的病毒积累量差异不明显。表明5种弱毒突变体均可作为弱毒株用于后续交叉保护实验。4.5种弱毒突变体保护接种番木瓜植株30天后,利用携带mCherry报告基因的PLDMV强毒株p35S-PLDMV-mCherry进行攻毒,交叉保护初步研究结果表明:攻毒60天后,5种弱毒突变体均表现出交叉保护作用,而弱毒突变体p35S-PLDMV-GFP-D和p35S-PLDMV-GFP-E比其他3种弱毒突变体(p35S-PLDMV-GFP-A、p35S-PLDMV-GFP-B和p35S-PLDMV-GFP-C)表现出更好的交叉保护效果。弱毒突变体p35S-PLDMV-GFP-D和p35S-PLDMV-GFP-E具有交叉保护的效果,可用于田间交叉保护防控PLDMV的研究和应用。