PTEN在神经干细胞分化成熟过程中的表达及其对轴突生长抑制作用的研究

作     者：沈华超 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁新生

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：神经干细胞 培养 鉴定 免疫荧光染色 分化 PTEN P-S6R PTEN,P-S6R 轴突生长 细胞转染 

摘      要：第一部分大鼠海马神经干细胞体外培养及鉴定目的:采用新生1天的Sprague-Dawley(SD)大鼠,提取其海马神经干细胞,进行传代培养及多向分化鉴定,为下一步实验提供神经干细胞来源。方法:取新生1天的Sprague-Dawley大鼠,分离海马制成细胞悬液,接种于25cm2培养瓶中,放入37℃、5%CO2培养箱中培养,通过机械吹打结合Accutase消化的方法传代,逐步纯化神经干细胞。倒置显微镜下观察细胞形态,通过免疫荧光染色对神经干细胞及其多向分化进行鉴定。结果:成功分离培养大鼠海马神经干细胞,神经干细胞呈球形生长,折光性较好,随着传代次数的增加,细胞进一步得到纯化;免疫荧光染色显示培养的细胞巢蛋白(Nestine)染色均为阳性,神经干细胞诱导分化7天后胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和β-微管蛋白III(β-tubulin III)免疫染色阳性。结论:从新生乳大鼠的海马中可提取原代神经干细胞,通过传代的培养方法可获得较高纯度神经干细胞,神经干细胞具有多向分化潜能,可以向神经元和星形胶质细胞分化。第二部分神经干细胞分化成熟过程中PTEN的表达及其意义目的:探讨PTEN在体外分离培养的大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)分化成熟过程中的表达及其意义。方法:体外分离培养大鼠海马神经干细胞,收集第三代神经干细胞,随机分为四组:0d组,1d组,3d组和7d组,分别诱导分化0d、1d、3d和7d,倒置显微镜下观察细胞形态变化,应用western blot检测第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)和反应雷帕霉素靶蛋白(m TOR)活性的磷酸化S6核糖体(P-S6R)蛋白的表达。细胞免疫荧光染色检测1d、3d和7d组P-S6R蛋白的表达。结果:Western blot结果显示,与0d和1d组相比,分化3d组PTEN表达明显增加(均p﹤0.01),7d组PTEN表达亦明显增加(p﹤0.01和p﹤0.05),而3d组和7d组P-S6R表达均明显下降(均p﹤0.01)。细胞免疫染色结果显示,分化3d组P-S6R阳性细胞比例显著下降,与1d组相比有明显差异(p﹤0.01);7d组P-S6R阳性染色的细胞比例仍然明显降低,与1d组相比有显著差异(p﹤0.01),与3d组相比,亦明显下降(p﹤0.05)。3d组和7d组的荧光强度明显减弱。结论:PTEN/m TOR信号通路参与调控神经干细胞的增殖分化和轴突生长,可能是导致神经干细胞分化成熟至一定阶段后增殖分化和轴突生长能力下降、不能建立有效的突触联系的重要原因之一。第三部分抑制PTEN对神经干细胞分化成熟后轴突生长的影响目的:探讨抑制PTEN对神经干细胞分化成熟后轴突生长的影响及可能的分子机制。方法:体外分离培养海马神经干细胞,收集第三代神经干细胞进行诱导分化,同时进行细胞转染,分为对照组,阴性转染组,PTEN转染组。转染48小时后Western blot检测PTEN和P-S6R的蛋白水平,观察各组细胞分化后轴突的数量、长度和细胞形态。结果:PTEN转染组PTEN蛋白表达显著降低,与对照组和阴性转染组相比,差异具有统计学意义,均p﹤0.01;与对照组和阴性转染组相比,PTEN转染组P-S6R的表达明显增高,均p﹤0.01。光镜下观察细胞形态,与对照组和阴性转染组相比,PTEN转染组神经干细胞分化7天后轴突数量和长度明显增加,胞体明显增大,阴性转染组与对照组相比细胞形态无明显差异。结论:抑制PTEN可明显增强神经干细胞分化成熟后的轴突生长能力,PTEN/m TOR信号通路是抑制神经干细胞分化后轴突内在生长能力的重要分子机制。