亚洲镰刀菌FgPkc基因小片段相关功能的鉴定

作     者：姚伟 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：廖玉才;李和平

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：亚洲镰刀菌 RNA干扰 原生质体转化 蛋白激酶C 

摘      要：禾谷镰刀菌是导致多种作物赤霉病的主要致病菌。赤霉病不仅导致农作物减产,给世界造成巨大的经济损失;其还产生多种毒素,包括单端孢霉烯B类毒素DON和NIV,这些毒素对人和家畜的健康造成巨大威胁。目前,使用多菌灵等咪唑类农药制剂是防治赤霉病的主要方法,该方法在过去一段时间内上取得了一定的效果;但是近年来,此类防治方法弊端日益突出。首先,农药污染问题日益严重;其次,多年频繁的使用农药,造成抗药突变菌株的不断涌现,防治效果越来越差。因此,建立新的赤霉病防治方法和防治体系迫在眉睫。本文利用RNA干扰技术,研究亚洲镰刀菌关键基因Fg Pkc不同片段的干扰效果。将该基因CDS序列分成8个片段,每个片段大小约为500bp,分别构建RNA干扰载体,并通过原生质体转化的方法,转入到亚洲镰刀菌5035菌株中。经过通用及特异PCR鉴定、Southern鉴定共得到10个单拷贝转化子。除片段3和5分别得到2个单拷贝阳性转化子外,其余片段均得到1个单拷贝阳性转化子。为进一步研究所得转化子的特性,进行了一系列实验,包括表型鉴定、田间花期接种、胚芽鞘接种以及分生孢子形态鉴定。主要结果如下:1.在SNA培养基上,培养4天后,转化子生长速率与野生型菌株具有明显差异,其中Pkc5-2和Pkc5-12生长最为缓慢,与野生型相比生长速率分别下降62.01%、63.67%;Pkc3-3生长速率下降幅度最小,为4.88%,Pkc8-16生长速率与野生型无明显差异。2.田间花期接种结果显示,除Pkc7-15外和野生型致病率无显著性差异外,转化子Pkc4-7,Pkc5-2,Pkc5-12、Pkc6-9与野生型菌株相比,致病率均有显著性降低。其中Pkc4-7,Pkc5-2,Pkc5-12田间致病率下降更为明显,与野生型菌株相比,分别下降72.10%、57.12%、54.96%(14天)。3.胚芽鞘接种显示,所有转化子致病率上与野生型相比均有极显著性(P0.01)下降。Pkc5-2,Pkc5-12致病率下降程度尤为显著,致病率分别下降60.75%、52.91%,与大田接种接种结果一致。4.转化子分生孢子形态发生变化,转化子产生的分生孢子均比野生型短,在宽度上与野生型无明显差别。综合上述实验结果,Fg Pkc基因为禾谷镰刀菌生长、致病相关的关键基因,将各基因片段沉默后,转化子表型在生长速率、田间致病率、胚芽鞘致病率与野生型相比均有极显著性的差异。尤其是第5个片段,其干扰效果更为明显,不论是其生长速率、田间致病率,还是胚芽鞘致病率与野生型相比均有极显著性差异,且比其他片段在干扰效果上更为明显。且第5个片段得到两个相互独立的单拷贝转化子,两个转化子的实验结果基本一致,进一步证明了Pkc第5个片段对亚洲镰刀菌的致病率起关键作用。可以将该片段构建植物表达载体中,其产生的si RNA抑制亚洲镰刀菌的生长,从而达到防治赤霉病的目的。