封闭galectins对伯氏疟原虫感染小鼠肝脏巨噬细胞的免疫调节作用研究

作     者：肖思宇 

作者单位：中山大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕芳丽

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：伯氏疟原虫 肝损伤 Tim-3/Gal-9 kupffer细胞 Ⅰ型干扰素 

摘      要：研究背景疟疾(malaria)是一种由疟原虫(Plasmodium spp.)引起的、以按蚊为媒介传播的全球性寄生虫病,是世界六大热带病和我国五大寄生虫病之一,目前全世界约有一半人口面临疟疾风险。疟疾是一种急性发热性疾病,最初症状如发热、头痛、寒战和呕吐可能因症状较轻而难以发现,而像儿童和孕妇等免疫力低下的人群常常发展为重症疟疾,出现贫血、急性呼吸窘迫、黄疸等症状,可造成脑、肺、肝、肾等全身各脏器不同程度的损害,最终可导致死亡。目前由于人口流动频繁,生态环境改变以及抗疟药耐药性的产生等综合因素,疟疾对人类健康的威胁仍然不容忽视。在重症疟疾患者普遍都能观察到不同程度的肝功能障碍,严重的患者可出现肝功能衰竭和肝细胞坏死,这与肝内炎性细胞的浸润和免疫病理反应密切相关。Kupffer细胞(KCs)是肝脏内的巨噬细胞,构成机体防御的一道屏障,同时免疫细胞产生的促炎因子也是导致肝损伤的重要原因之一。红细胞内期是疟疾致病的主要阶段,肝脏微血管内的疟原虫通过表面特异性标志入侵、增殖并裂解红细胞,促使肝脏内的KCs大量聚集。这个过程可导致肝脏损害,说明单核巨噬细胞的浸润增生参与肝脏的免疫病理反应。同时,疟原虫感染可诱导Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)的产生,通过IFN-α/β激活基因(ISGs)募集大量炎性细胞在肝内聚集,参与固有免疫反应来遏制疟原虫的增殖。因此,维持各种炎症因子之间的动态平衡对疟疾的结局甚为关键,但其具体的调控机制目前尚不清楚。T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子家族(T cell immunoglobulin mucin,Tim)是一类结构保守并具有重要免疫功能的新型的基因家族蛋白,其中Tim-3主要表达在Th1细胞上,能产生抑制信号导致Th1细胞的凋亡,下调Th1介导的免疫应答。凝集素家族中的半乳糖凝集素(Galectin,Gal)-9是Tim-3主要的天然配体,主要表达于CD4+T细胞表面。其选择性地结合β-半乳糖苷,与Th1细胞上的Tim-3分子特异性结合后负性刺激Th1细胞程序性死亡来抑制Th1细胞免疫功能。在病原体感染中,Tim-3和Gal-9的相互作用促进巨噬细胞吞噬病原体同时抑制T细胞应答,在急性炎症中促进T细胞凋亡而在慢性炎症中介导CD8+T细胞耗竭与无能。研究显示,NKT细胞Tim-3表达上调诱导KCs表达Gal-9,同时分泌IFN-γ导致Tim-3+NKT细胞的凋亡,可限制了炎症反应并避免破坏性免疫。目前关于Tim-3/Gal-9在疟疾肝损伤中的作用报道尚少见,本研究对其进行探讨,以期为疟疾肝损伤的防治提供新的靶向目标。研究目的和意义本论文采用Plasmodium berghei ANKA(Pb ANKA)感染小鼠,通过乳糖封闭galectins研究伯氏疟原虫感染小鼠肝脏巨噬细胞的免疫调节作用研究。我们的研究结果显示,Tim-3/Gal-9通路作用于KCs,可能通过调节Ⅰ型干扰素的分泌参与疟原虫伯氏感染小鼠肝脏的免疫病理反应。第一部分1)材料和方法(1)伯氏疟原虫感染小鼠模型的建立雌性昆明小鼠腹腔注射感染1.0×106个Pb ANKA,建立鼠疟模型。(2)伯氏疟原虫感染小鼠分组及观察感染后观察小鼠生存状况;每2日从小鼠尾部采血,制备薄血膜,检测小鼠血虫感染率的动态变化,分别于感染后5、10、15和20天处死小鼠。(3)伯氏疟原虫感染小鼠组织虫荷检测采用q RT-PCR检测小鼠感染后5、10、15和20天肝、脾组织Pb ANKA虫荷m RNA表达的动态变化。(4)伯氏疟原虫感染小鼠组织病理观察肝、脾组织石蜡切片后进行H&E染色,观察并计数分析小鼠感染后肝、脾组织病理动态变化。(5)伯氏疟原虫感染小鼠组织Tim-3和Gal-9免疫组织化学染色肝、脾组织石蜡切片后进行Tim-3和Gal-9免疫组织化学染色,观察并计数小鼠感染后肝、脾组织Tim-3和Gal-9阳性细胞数量的动态表达。(6)伯氏疟原虫感染小鼠组织细胞因子检测采用q RT-PCR检测小鼠感染后肝、脾组织Tim-3、Gal-9、促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)和抑炎因子(IL-10和IL-4)的m RNA表达水平的动态变化。2)结果(1)小鼠感染后7至20天内死亡,临死前的血虫感染率为62.61%‐78.63%。(2)感染小鼠肝、脾组织中Pb ANKA虫荷量动态升高。与感染后5天相比,肝脏和脾脏组织虫荷量在感染后10(P0.05)、15(P0.001)和20天(P0.001)显著增高;与感染后10天相比,肝脏和脾脏组织中的虫荷量在感染后15和20天显著增高(分别为P0.001和P0.05)。(3)感染小鼠肝、脾组织病理损害随着时间的延长逐渐加重。(4)小鼠感染后肝、脾组织中Tim-3和Gal-9阳性细胞数量逐渐增多。(5)与正常小鼠相比,感染小