小麦全蚀病菌胞外β-1，3-葡聚糖酶Ⅱ的分离纯化及性质研究

作     者：余永廷 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄丽丽

授予年度：2005年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：同工酶 非变性PAGE 特异性染色 电洗脱 酶学性质 

摘      要：小麦全蚀病是一种世界范围内普遍发生的重要根部病害和重点防治对象,给小麦生产带来重大的损失。由于全蚀病的致病机理研究还很薄弱,加之目前尚无有效的抗性品种和化学药剂,全蚀病的防治仍是小麦生产中的一大难题。 小麦全蚀病菌致病机理的研究显示,病菌侵染麦根的过程,不仅与纤维素酶和木聚糖酶等细胞壁降解酶有关,还可能涉及胞外β-1,3-葡聚糖酶。因此,本研究小组对小麦全蚀病菌胞外β-1,3-葡聚糖酶进行了系统研究,其目的是为进一步全面揭示小麦全蚀病菌致病过程的细胞化学和分子生物学机理奠定基础,同时也为进一步开展抗全蚀病的生物工程研究提供理论依据。本论文在课题组前期工作的基础上,对全蚀菌产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶同工酶进行了分离纯化和酶学性质研究,取得以下重要研究结果表明: 1. 硫酸铵梯度沉淀研究发现,55%饱和度的硫酸铵就基本可以将小麦全蚀病菌液体振荡培养液中的目的蛋白全部析出。 2. 小麦全蚀病菌产生的胞外β-1,3-葡聚糖酶主要存在两种同工酶(β-1,3-葡聚糖酶Ⅰ和?-1,3-葡聚糖酶Ⅱ),并且?-1,3-葡聚糖酶Ⅱ的表达量相对较大,?-1,3-葡聚糖酶Ⅰ的表达量较小。 3. 粗酶液经Sephadex G-150 凝胶过滤层析分离,出现两个紫外光吸收峰,各收集部分酶活力也出现两个主要吸收峰,根据各收集部分的酶活力大小及它们在层析图谱上所出现的位置,证实粗酶液主要含有两种β-1,3-葡聚糖酶同工酶。 4. 经过非变性PAGE分离胶浓度的筛选,确定了达到两种?-1,3-葡聚糖酶同工酶的最佳分离效果的分离胶浓度为7.5%。 5. 电洗脱回收了经非变性PAGE(分离胶浓度为7.5%、浓缩胶浓度为3.9%)分离的同工酶(表达量较大的GluⅡ),经电泳检测达到电泳纯。 6. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ由两个亚基组成,它们的分子量分别为63.2KD 和73.7KD。 7. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ的等电点为8.6。 8. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ最适反应温约为50℃,在60℃时比较稳定;最适反应pH值5.0 左右,pH4.0～7.0 较稳定;Mn2+对其酶活力有显著的激活作用,而Co,Hg对其酶活力有明显的抑制作用,Mg2+对该酶酶活力有轻微的抑制作用,Fe,Zn,Ca,Ba对酶活力基本没有影响。 9. β-1,3-葡聚糖酶Ⅱ对昆布多糖的Km 为4.909 mg/mL , Vmax 为