乙型肝炎病毒基本核心启动子变异对启动子活性及病毒复制力影响的研究

作     者：王耀 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张焱如;徐东平

授予年度：2010年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：乙型肝炎病毒 基本核心启动子 变异 复制力 

摘      要：乙型病毒性肝炎是一种世界性的传染病,由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染所引起,是肝衰竭、肝硬化和肝癌发生的高危因素。HBV由于其多聚酶/反转录酶(RT)缺乏校对功能,极易发生变异,是高变异病毒,其内部基本核心启动子(basal core promoter, BCP)基因序列的保守性对于维持病毒的活跃复制非常关键,该区变异可以影响HBV的复制力,降低病毒e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)的合成,从而导致不同的临床结局。目前,BCP区的热点突变有T1753A/C、A1762T、G1764A、C1766T等,其中最为常见的是A1762T/G1764A双联突变,此外,C1766T/T1768A双联突变,以及A1762T/G1764A/C1766T和T1753C/A1762T/G1764A/C1766T等多联突变也较为常见。本实验通过对解放军第302医院近年收治的40例慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者及40例慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure, ACLF)患者HBV全基因组的克隆及热点突变的统计分析,并进一步挑选BCP区G1764A/C1766T/T1768A三联突变样品,研究该突变对启动子活性和HBV全基因组复制力的影响。本研究的主要结果如下: 1.患者临床资料经统计分析后发现,CHB患者的HBeAg阳性率和HBV DNA载量高于ACLF患者(P0.05),而总胆红素(total bilirubin, TBIL)含量则低于ACLF患者(P0.05),提示以上因素与乙型肝炎重症化可能存在相关性。 2.通过对80例血清样本的全基因组克隆及对BCP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中发生频率为0.0%(0/40),而在ACLF患者中发生频率高达12.5%(5/40)(P0.05),提示该突变与乙型肝炎重症化可能存在相关性。 3.运用MEGA 4.0软件对HBV全序列构建进化树进行HBV基因分型,其中40例CHB患者中,B型9例占22.5%;C型30例占75.0%;D型1例占2.5%;40例ACLF患者中,B型8例占20.0%;C型31例占77.5%;D型1例占2.5%;两组患者未发现基因型分布的差异。 4.构建pGL3-BCP荧光素酶报告载体,经过定点突变及细胞转染技术,双荧光素酶的检测结果显示:典型BCP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍,提示该三联突变对启动子活性具有上调作用。 ***全基因组经过定点突变及细胞转染技术,荧光定量检测结果显示:典型BCP双联突变A1762T/G1764A病毒株的全基因组复制力为相应野生株的1.56倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的全基因组复制力为相应野生株的1.54～2.49倍,提示该突变可以增加HBV DNA的复制水平。 总之,通过对CHB患者和ACLF患者HBV全基因组的克隆及序列分析,以及BCP区G1764A/C1766T/T1768A三联突变对启动子活性以及病毒全基因组复制水平影响的研究,明确了该三联突变的生理功能,有助于理解HBV DNA BCP突变特征及在乙型肝炎的重症化进程中的分子病毒学机制。