分子改造提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性

作     者：童理明 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李江华

授予年度：2016年

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070303[理学-有机化学] 0703[理学-化学] 

主      题：谷氨酰胺转胺酶 热稳定性 折叠自由能 定点突变 双亲短肽 

摘      要：谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase,EC 2.***.2.13,TGase),是一种能催化蛋白质交联的酰胺转移酶。由于催化活性不依赖于Ca2+,来源于链霉菌的TGase广泛应用于食品、纺织、皮革及生物医药领域。但较低的TGase的热稳定性,使链霉菌TGase作为优良的催化剂在工业中的应用受到严重的限制。本研究以来源于吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)WSH03-13的TGase为研究对象,应用定点突变、短肽融合及两者组合的策略提高TGase的热稳定性,主要研究结果如下:(1)定点突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性通过PoPMusic-2.1预测了降低TGase分子折叠能的氨基酸位点P132和分子结构模拟选中来源于吸水链霉菌的TGase基因中的W388号位点,并构建了相应的突变体。酶学分析表明,突变体P132I在50℃水浴下的半衰期达到5 min,较野生TGase提高31%;P132号位点其他的突变体较野生酶提高2-13.7%。对W388号位点的饱和突变则未能得到热稳定性提高的突变体。此外,P132I和P132G比酶活亦分别较野生酶提高24%和12.4%,其它突变体比酶活变化不明显。作用力分析发现,突变体P132I中较野生TGase增加两个氢键。上述结果表明,基于蛋白质折叠自由能分析的定点突变能有效提高TGase的热稳定和催化活性,氢键的增加可能是P132I热稳定性提高的原因之一。(2)融合双亲短肽提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性将来源于Saccharomy cescerevisiae Zuotion蛋白的双亲短肽SAP1融合至TGase前导肽C端、成熟酶N端及C端,分别得到TGase融合酶QC-SAP1、N-SAP1和C-SAP1;将N端loop作为linker连接成熟酶的C端与双亲短肽SAP1得到融合C-L-SAP1。与野生酶相比,突变体N-SAP1在50℃下的半衰期提高78.9%,其它三个突变体则提高5-24%;各突变体比酶活下降4-30.3%。结构分析显示,N-SAP1蛋白颗粒较野生酶显著增大,且各突变体与野生酶的二级结构基本一致。上述结果表明,末端融合双亲短肽SAP1能有效的提高TGase的热稳定性,酶蛋白聚合有可能是突变体热稳定性提高的重要原因。(3)复合突变提高谷氨酰胺转胺酶热稳定性为进一步提高TGase的热稳定性,将N-SAP1中的P132分别突变为异亮氨酸、甘氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺,构建得到TGase复合突变体N-P132I、N-P132G、P132M以及P132Q。酶学分析表明,突变体N-P132I较野生TGase相比在50℃下的半衰期提高105%,其他的突变体较野生TGase提高68.4-100%。复合突变后,4个突变体的比酶活相比野生TGase下降6.5-14.5%,其中突变体N-P132I的比酶活下降了14.5%。上述结果说明,结合两种改造策略能有效提高TGase的热稳定性,同时保证较高的催化活性。